1、食品微生物检测简述微生物微生物介绍介绍菌种保藏菌种保藏微生物检测微生物检测010203目录微生物介绍 所谓微生物是指个体微小，必须借助于显微所谓微生物是指个体微小，必须借助于显微镜才能看清它们外形的一群低等的、原始的镜才能看清它们外形的一群低等的、原始的微小生物，如细菌。微小生物，如细菌。什么是微生物？微生物介绍微生物的特点 微生物是结构简单、繁殖快、分布广、个体最小的生物。结构简单：微生物多数是单细胞,有的具有细胞构造，有的甚至没有细胞构造；生长旺，繁殖快（大肠杆菌在它的适宜37-44之间，20-30分钟繁殖一代）；分布广.种类多（10万多种）：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等；个体小：
2、小于0.1mm，肉眼不可见。适应性强，易变异；代谢强，转化快；微生物介绍 真核细胞型微生物真核细胞型微生物细胞核分化程度高，有核膜和核仁，细胞器完整。如真菌。原核细胞型微生物原核细胞型微生物细胞核的分化较低，仅有原始核，无核膜、核仁。细胞器很不完善。DNA和RNA同时存在。这类微生物众多，有细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。非细胞型微生物非细胞型微生物是最小的微生物一类微生物。无典型的细胞结构，只能在活细胞内生长繁殖。核酸类型为DNA或RNA。病毒属之。微生物的分类微生物介绍 环境条件一定范围的变化，影响形态生理生长繁殖 极端环境条件对微生物的影响死亡 微生物生长的主要环境因子温
3、度O2水分pH值氧化还原点位化学药物、辐射等微生物介绍微生物实验室常规仪器设备 电子天平：0.1g；0.01g；pH计；加热装置：电炉、微波炉；高压灭菌锅微生物介绍 高压锅：灭菌检测产品 1、压力灭菌指示卡（121）；2、生物指示剂 （121，15min）干燥灭菌箱；水浴锅微生物实验室常规仪器设备微生物介绍 超净工作台/生物安全柜1、区别：保护对象不同微生物实验室常规仪器设备操作者样品环境超净工作台生物安全柜微生物介绍微生物实验室常规仪器设备 生物安全等级P1P2P3P4普通无害微生物（细菌总数、大肠菌群、粪大肠菌群）一般可治病微生物（沙门、副弧、金葡、单增、空弯、O157）烈性微生物，可治愈
4、（肉毒杆菌、炭疽杆菌）烈性微生物，无法治愈（鼠疫耶尔森氏菌）微生物介绍 操作台内的灭菌设备1、酒精灯；2、红外线灭菌器；3、电子火焰灭菌器；培养箱1、一般恒温培养箱；2、厌氧培养箱（厌氧培养罐）微生物实验室常规仪器设备微生物检测GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定；GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数；GB 4789.15-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数；GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验；GB 4789.10-2016 食品安全国家标准
5、 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验；GB 4789.30-2016 单核细胞增生李斯特氏菌检验；微生物检测菌落总数测定 菌落总数 aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每mL(g)检样中形成的微生物菌落总数。微生物检测菌落总数测定卫生学意义：食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求。加工、贮存运输过程中是否受到污染卫生质量 卫生学指标：菌落总数和致病菌有本质区别，必须配合其他病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确的评定微生物检测菌落总数测定微生物检测编编 号号菌落总数菌落总数报告方式报告方
6、式单单 位位195.596CFU/g或CFU/mL（CFU大写）216801700或1.71033均为蔓延菌落无法计数报告“菌落蔓延”4空白对照有菌结果无效计数和报告结果报告微生物检测 必须做空白对照：必须做空白对照：监测培养基、平皿、稀释液的无菌程度。同时，应在工作台内打开一块空白PCA（其暴露时间应与检样时间相当），以了解样品在检验过程中有无受到来自环境的污染 水浴和倾注温度：461 培养条件：一般样品361/48h2h，水产品（指原生态、未加工水产品）301/72h3h注意事项微生物检测 如样品（干调、面粉、脱水蔬菜）中可能含有在琼脂表面蔓延生长的菌落，可在凝固后的琼脂表面再覆盖一层（4
7、mL）培养基 样品稀释液有时会带有细碎的食物颗粒（如奶粉、坚果），为避免这些颗粒与菌落发生混淆，可将样品稀释液与PCA混合，单做培养，置于4冰箱放置同样时间，以便在计数时作为对照。注意事项微生物检测大肠菌群计数 定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品该菌主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据
8、进一这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。和阴沟肠杆菌等。微生物检测 检验原理：检验原理：MPNMPN法法：是统计学和微生物学结合：是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出释度，应用统计学概率论推算出待测
9、样品中大肠菌群的最大可能待测样品中大肠菌群的最大可能数。数。平板计数法平板计数法：大肠军群在固体培：大肠军群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落色，带有或不带有沉淀环的菌落。大肠菌群计数微生物检测霉菌和酵母计数马铃薯葡萄糖琼脂马铃薯葡萄糖琼脂孟加拉红培养基孟加拉红培养基微生物检测 两种培养基都含有氯霉素，可以抑制细菌的生长；两种培养基都含有氯霉素，可以抑制细菌的生长；对氯霉素耐药的一些细菌在这两种培养基上也会生对氯霉素耐药的一些细菌在这两种培养基上也会生长，可以通过长，可以通过菌落形
10、态菌落形态来区分，或者通过来区分，或者通过染色镜检染色镜检来判定；来判定；如果需要分开报告霉菌和酵母菌的数量，主要通过如果需要分开报告霉菌和酵母菌的数量，主要通过菌落形态菌落形态来区分。来区分。培培养基的使用养基的使用霉菌和酵母计数微生物检测细菌：由于细胞小，形成的菌落较小，较薄、细菌：由于细胞小，形成的菌落较小，较薄、较透明、且有较透明、且有“细腻感细腻感”。可产生不同色素，。可产生不同色素，菌落可呈现五颜六色且形态多样。菌落可呈现五颜六色且形态多样。酵母菌：由于细胞较大且不能运动，一般菌落酵母菌：由于细胞较大且不能运动，一般菌落比细菌大、厚且透明度差。产生色素较单一，比细菌大、厚且透明度差
11、。产生色素较单一，通常乳白色，少数为橙红色，个别黑色。通常乳白色，少数为橙红色，个别黑色。霉菌：菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，霉菌：菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状；不透明，呈现蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状；菌落与培养基间的联系紧密，不易挑起，菌落菌落与培养基间的联系紧密，不易挑起，菌落正面与反面、边缘与中心的颜色和构造常不一正面与反面、边缘与中心的颜色和构造常不一致。致。细菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形态细菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形态微生物检测细菌：包括三种基本细菌：包括三种基本形态，球状、杆状和形态，球状、杆状和螺旋状螺旋状细菌、酵母菌及霉菌的
12、镜检形态细菌、酵母菌及霉菌的镜检形态v 霉菌：细胞构造霉菌：细胞构造与酵母菌相似，但与酵母菌相似，但以菌丝体形式存在以菌丝体形式存在v 酵母菌：细胞通酵母菌：细胞通常有球状、卵圆状、常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香椭圆状、柱状和香肠状肠状微生物检测微生物检测致病菌检验综合鉴定结果分离（选择性培养基通常2种）初筛生化鉴定血清学鉴定 前增菌选择性增菌判定检出/未检出结论：微生物检测检验流程检验流程 前增菌前增菌 选择性增菌选择性增菌 选择性分离选择性分离生化鉴定生化鉴定血清学鉴定血清学鉴定微生物检测 任何样品均需进行前增菌。任何样品均需进行前增菌。缓冲蛋白胨水（缓冲蛋白胨水（BPWBPW）：不含
13、任何抑菌成分，有利于受损沙门氏）：不含任何抑菌成分，有利于受损沙门氏菌的复苏，使受损伤细胞恢复到稳定的生理状态。菌的复苏，使受损伤细胞恢复到稳定的生理状态。冷冻样品解冻：冷冻样品解冻：4545以下不超过以下不超过15min15min，或，或2-52-5不超过不超过18h18h。增菌时间：增菌时间：8h-18h8h-18h。SC:u亚硒酸盐抑菌亚硒酸盐抑菌;胱氨酸促生长胱氨酸促生长;u适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，37 TTB:u四硫酸钠和煌绿抑菌四硫酸钠和煌绿抑菌;u适合其他沙门菌生长，适合其他沙门菌生长，42;为防漏检宜为防漏检宜SC+TTB前增
14、菌选择性增菌微生物检测 分别用分别用3mm3mm接种环取增菌液接种环取增菌液1 1环，划线接种于一个环，划线接种于一个BSBS琼琼脂平板和一个脂平板和一个XLDXLD琼脂平板（或琼脂平板（或HEHE琼脂平板或沙门氏琼脂平板或沙门氏菌显色培养基平板），于菌显色培养基平板），于363611分别培养分别培养18h18h24h24h（XLDXLD、HEHE、显色培养基）或、显色培养基）或40h40h48h48h（BSBS琼脂平琼脂平板）板）为了最大可能的检出沙门氏菌，必须使用两种或以上为了最大可能的检出沙门氏菌，必须使用两种或以上选择性分离培养基选择性分离培养基选择性分离微生物检测鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒
15、沙门氏菌大肠埃希氏菌弗氏志贺氏菌XLD琼脂BS琼脂选择性分离微生物检测HE琼脂选择性分离鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌 大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌沙门氏菌显色培养基微生物检测生化鉴定微生物检测血清学鉴定 血清学作为鉴定的一部分，必须完成血清学作为鉴定的一部分，必须完成 实验室必须配备沙门氏菌的实验室必须配备沙门氏菌的自凝性自凝性、多价菌体（）多价菌体（）和和多多价鞭毛（）价鞭毛（）诊断血清诊断血清 其中血清学分型为选作试验项目其中血清学分型为选作试验项目 血清学试验必须基于生化试验的结果，不能单纯以血清学血清学试验必须基于生化试验的结果，不能单纯
16、以血清学实验结果来报告最终结果实验结果来报告最终结果。微生物检测血清学鉴定34从营养琼脂上挑取一环纯化菌落，用无菌接种环分别将两个区域内的菌落研成乳状液在玻片上划出两个区域，一边滴加1滴O多价血清，另一边加入1滴生理盐水，作为对照结果观察自凝性检查及O多价鉴定菌种保藏不乱不乱菌种保藏是微生物学及相关工作的一项重要菌种保藏是微生物学及相关工作的一项重要内容，也是我们检测工作中的一项常用技术内容，也是我们检测工作中的一项常用技术不变不变保持保持原有性状原有性状不乱不乱不死不死保持活力保持活力 而不死而不死不乱不乱不杂不杂保证纯培养保证纯培养防止污染防止污染菌种保藏选择最适宜的保藏方法选择最适宜的保藏方法4123010203挑选特征典型的纯菌菌落确定保藏的合适菌体形态选择最适宜的保藏方法04定期对保藏菌种进行检查菌种保藏保藏方法长期保藏法长期保藏法 短期保藏法短期保藏法 定期移植保藏法：试管斜面 穿刺培养 疱肉培养基培养（保藏厌氧菌）冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法液氮冷冻法液体石蜡保藏液体石蜡保藏甘油管保藏法甘油管保藏法载体保藏法：载体保藏法：沙土管保藏滤纸片保藏菌种菌种菌种保藏保藏方法 磁珠保藏菌种方法 刮取新鲜纯培养物，配置3-4麦氏浊度的菌悬液。加入到保存管中，拧紧，来回颠倒4-5次，磁珠会吸附菌体，然后将培养液吸取干净。置于-20或-70，或液氮中保存
