1、基于基于高通量高通量测序的测序的菌群谱菌群谱研究研究中医药方向中医药方向1主要内容主要内容一、中医药微生态概述一、中医药微生态概述二、菌群谱的二、菌群谱的检测方法检测方法三、生物信息分析内容及意义三、生物信息分析内容及意义四、案例解析四、案例解析234 建议“6+2”模式，即人体、环境、农作物、家养动物肠道、工业以及海洋等6个领域的微生物组研究，加上微生物组研究方法及应用技术平台和微生物组数据储存及功能挖掘两个方向。2016年年7月，50多位院士专家支持中科院微生物所的倡议，向国务院建议尽快启动中国微生物组计划，并得到积极回应。5中国微生物组计划中国微生物组计划肠道微生态肠道微生态成人胃肠道微
2、生物重量超过1kg，约编码330万个特异基因，是人类基因组编码基因数的150多倍；人类第二套基因组；人类是超级生物体。6人类肠道优势菌人类肠道优势菌7资料来自Hakansson A等的文章人类肠道优势菌人类肠道优势菌8资料来自Hakansson A等的文章人类肠道优势菌人类肠道优势菌9资料来自Hakansson A等的文章肠道微生物的功能及相关疾病肠道微生物的功能及相关疾病10中医药微生态研究历史和进展中医药微生态研究历史和进展早在公元4世纪，中医师葛洪曾用粪便悬浮液治疗食物中毒和严重腹泻；公元16世纪，李时珍在本草纲目中有用粪便治病的记载；20世纪，我国微生态学创始人魏曦教授曾预言：“微生态
3、学很可能成为打开中医奥秘大门的一把金钥匙”；2012年，上海交大赵立平教授在Science上发表题为我的微生物组和我的新闻报道，介绍了其如何把中医药学和菌群研究结合，并以此与肥胖斗争的故事。这开启了中医药与菌群关系研究的新纪元；2014年，上海交大赵立平教授和中国中医科学研究院仝小林教授等，在国际微生态学领域的顶级学术期刊The ISME Journal发表题为一种中草药复方缓解2型糖尿病时的肠道菌群改变的研究成果；2015年，台湾长庚大学学者在 Nature Communications发表题为灵芝通过调节肠道菌群的组成而降低小鼠肥胖的研究成果；2016年，台湾长庚大学学者在 Nature子
4、刊发表题为植物和蘑菇对抗肥胖和糖尿病的分子机制的综述；2017年，香港浸会大学陈虎彪教授和江苏省中医药研究院李松林研究员等的综述Understanding the Molecular Mechanisms of the Interplay Between Herbal Medicines and Gut Microbiota 在线发表在Wiley Online Library；11人参皂苷人参皂苷Rb1肠道生物转化过程中肠道菌群的关键作用肠道生物转化过程中肠道菌群的关键作用资料来自Jun Xu等的文章12与草药代谢相关的肠道菌群与草药代谢相关的肠道菌群资料来自Jun Xu等的文章13与草药代谢
5、相关的肠道菌群与草药代谢相关的肠道菌群资料来自Jun Xu等的文章14与草药代谢相关的肠道菌群与草药代谢相关的肠道菌群资料来自Jun Xu等的文章15与草药代谢相关的肠道菌群与草药代谢相关的肠道菌群资料来自Jun Xu等的文章16草药通过靶向肠道菌群的潜在治疗机制草药通过靶向肠道菌群的潜在治疗机制资料来自Jun Xu等的文章17草药靶向治疗肠道菌群草药靶向治疗肠道菌群资料来自Jun Xu等的文章18草药靶向治疗肠道菌群草药靶向治疗肠道菌群资料来自Jun Xu等的文章19草药靶向治疗肠道菌群草药靶向治疗肠道菌群资料来自Jun Xu等的文章20草药靶向治疗肠道菌群草药靶向治疗肠道菌群资料来自Jun
6、 Xu等的文章21草药与哺乳动物肠道菌群的互作网络草药与哺乳动物肠道菌群的互作网络资料来自Jun Xu等的文章22草药与菌群的互作方式草药与菌群的互作方式（1）肠道菌群将草药化学成分生物转化成代谢物质，而这些物质的生物利用度、生物活性及毒性与其前体不同；（2）草药化学成分改善肠道菌群结构，从而改善其功能失调状态及相关的病理条件；（3）肠道菌群介导草药多种化学成分之间的相互作用；23中医药微生态研究的机遇和挑战中医药微生态研究的机遇和挑战 中医药微生态研究是我们难得的历史性的机遇，建议投入更多的团队和资源，而且需要顶层设计；挑战挑战（1）对于与肠道菌群相关的中医药化学成分，需要更多的整体化学特征
7、的研究：是否发酵的金银花；（2）对于中医药靶标肠道菌群，需要更多的微生物学的研究：麝香草酚；（3）需要靠谱的中医药肠道微生态研究模型：人源化老鼠；24机遇机遇二、菌群结构谱的检测方法二、菌群结构谱的检测方法25菌群结构谱的检测方法菌群结构谱的检测方法 在细菌的进化过程中，rRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺。rRNA结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘关系，高变性则揭示生物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。25菌群结构谱检测方法菌群结构谱检测方法罗氏罗氏454(2005)Hiseq2500(2014)Miseq(2011)19901960DGG
8、ET-RFLPClone libraryPacbio(2009)RT-PCR27PlatformMethodCharacteristic16S rRNACommentsSangerFluorescent,dideoxy terminator750 bpHigh accuracyFull length Costly,Low throughput,low coverage of 16S 454Pyrosequencing light emission600 bpHigh accuracyUp to 3 variable regions per readCost limits 16S coverag
9、e MiSeqFluorescent,stepwise sequencing500600 bpHigh accuracyUp to 3 variable regions per readVery high coverage and very low costPacBioFluorescent,SMRT DNA sequencing8 KbLow accuracy,allievated by CCSFull lengthRelatively low cost,Finer phylogenetic resolution菌群结构谱的检测方法菌群结构谱的检测方法28基因组基因组DNA提取提取设计并合成
10、含接头引物设计并合成含接头引物PCR扩增及产物纯化扩增及产物纯化PCR产物定量及均一化产物定量及均一化Miseq高通量测序高通量测序Miseq PE文库制备文库制备菌群结构谱的检测方法菌群结构谱的检测方法高保真酶；最低循环数；精确定量29 样品采集：采样方法、生物学重复、样品保存样品采集：采样方法、生物学重复、样品保存 测序前准备测序前准备：DNA抽提，抽提，PCR 平台选择平台选择：illumina Miseq/Hiseq；Pacbio 区域选择区域选择：细菌（：细菌（V3-V4 ）；真菌（）；真菌（ITS）；古菌（）；古菌（V3-V5）测序量：测序量：30000 所需分析：标准分析所需分析
11、：标准分析+高级分析高级分析准备准备30三、生物信息分析内容及意义三、生物信息分析内容及意义31生物信息分析内容及意义生物信息分析内容及意义?样本自身所含微生物的多样样本自身所含微生物的多样性程度（性程度（Alpha多样性多样性）样本间微生物多样性比较（样本间微生物多样性比较（Beta多样性多样性）环境因子的影响（对样本或环境因子的影响（对样本或者微生物）者微生物）菌群代谢功能预测菌群代谢功能预测常规分析项目常规分析项目Alpha多样性分析多样性分析1Rarefaction稀疏曲线稀疏曲线2Specaccum物种累积曲线物种累积曲线样本样本 103丰度等级曲线丰度等级曲线4Alpha多样性指数
12、计算多样性指数计算分类组成分析分类组成分析1各分类水平的微生物类群数统计各分类水平的微生物类群数统计2各分类水平的分类学组成分析各分类水平的分类学组成分析3Metastats分析分析样本（组）样本（组）24LEfSe分析分析分组分组 2群落组成交互式可视化群落组成交互式可视化1系统发育树构建系统发育树构建2MEGAN可视化展示可视化展示3GraPhlAn可视化展示可视化展示4Krona交互式展示交互式展示5热图分析热图分析样本样本 3Beta多样性分析多样性分析1PCA分析分析样本样本 32UniFrac-PCoA分析分析样本样本 33UniFrac-MDS分析分析样本样本 54UniFrac
13、-UPGMA聚类分析聚类分析样本样本 35基于基于UniFrac距离的多组比较和箱线图展示距离的多组比较和箱线图展示分组分组 2分析项目分析项目备注备注高级分析项目高级分析项目菌群比较分析和关键物种筛选菌群比较分析和关键物种筛选1 RDA分析分析样本样本 3：提供影响因素数值或分组：提供影响因素数值或分组 22 2 物种网络分析物种网络分析3 3 菌群功能预测菌群功能预测32错误率与质量值换算的公式：Q=-10 log 10(E)Fastaq文件文件：HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:1946 1:N:0:ATTCCT ATNATGACTCAAGCGCT
14、TCCTCAGTTTAATGAAGCTAACTTCAATGCTGAGATCGTT +HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:1946 1:N:0:ATTCCT?A#AFFDFFHGFFHJJGIJJJIICHIIIIJJGGHIIJJIIJIIJIHGIFEHIIJBFFHGJJIIHHHDFFFF信息分析内容信息分析内容33OTU聚类 OTU（Operational Taxonomic Units）是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就
15、需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平（通常为97%），对所有序列进行OTU划分。有效数据优化数据信息分析内容信息分析内容34分类学分析Qiime分类学分析（http:/qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）将序列与greengene等数据库比对某OTU的种属信息：同一个OTU中的不同序列的最近祖先的种属信息OTU nameABOTUsizesuperkingdomphylumclassOTU1 100150250BacteriaProteobacter
16、iaBetaproteobacteriaOTU250100150BacteriaProteobacteriaGammaproteobacteria35稀释性曲线36Rank Abundance 曲线051003006009001200O TU RankO TU Abundance(l og2)ATM61ATM62ATM63ATM65C61C62C63C65Rank Abundance Curve37Specaccum物种累积曲线38单个样品的群落结构组分图39单个样品的群落结构组分图40OTU分布VENN图多样品相似度树状图41多个样品的菌群结构谱柱形图42菌群结构谱Heatmap图43 PC
17、A44物种差异显著性分析45LEfSE46LEfSE:47RDA/CCA48优势物种互作关联网络分析49菌群代谢功能预测50四、案例解析四、案例解析51案例分析案例分析52 实验设计：检测高脂饮食组，以及高脂饮食+灵芝水提物干预组小鼠肠道菌群谱变化，同时用正常饮食组，以及正常饮食+灵芝水提物干预组作为对照；采集并统计多项生理生化指标；通过向高饮食组移植其他组分的粪便来验证，并检查粪便菌群谱变化；分离并验证灵芝水提物活性物质。测序策略：采用罗氏454平台，对16S rRNA V3-V5区测，引物为338F-907R。结论：灵芝水提物通过调节肠道菌群谱而缓解小鼠肥胖。灵芝通过调节肠道菌群谱缓解小鼠
18、肥胖灵芝通过调节肠道菌群谱缓解小鼠肥胖5354正常饮食组正常饮食+喂食8%灵芝水提物组高脂饮食组高脂饮食+喂食2%灵芝水提物组高脂饮食+喂食4%灵芝水提物组高脂饮食+喂食8%灵芝水提物组实验设计采集统计多项生理生化指标检测分析菌群谱变化情况发现灵芝水提物不仅可以降低高脂饮食小鼠体重、炎症和胰岛素抵抗，还可以降低肠道菌群的厚壁菌拟杆菌门比值和内毒素浓度，同时维持肠屏障完整性。向高脂饮食组移植正常饮食组粪便向高脂饮食组移植正常饮食+喂食8%灵芝水提物组向高脂饮食组移植高脂饮食组粪便向高脂饮食组移植高脂饮食+喂食8%灵芝水提物组采集统计多项生理生化指标检测分析菌群谱变化情况发现将喂养灵芝水提物的小鼠
19、粪便移植给高脂饮食小鼠，与直接喂食灵芝水提物效果类似。正常饮食组正常饮食+喂食8%灵芝水提物组正常饮食+喂食30万Da以上灵芝粗提物组正常饮食+喂食10-30万Da灵芝粗提物组正常饮食+喂食10万Da以下灵芝粗提物组正常饮食+喂食某不明确芝粗提物组高脂饮食组高脂饮食+喂食8%灵芝水提物组高脂饮食+喂食30万Da以上灵芝粗提物组高脂饮食+喂食10-30万Da灵芝粗提物组高脂饮食+喂食10万Da以下灵芝粗提物组高脂饮食+喂食某不明确灵芝粗提物组灵灵芝芝水水提提物物通通过过调调节节肠肠道道菌菌群群谱谱而而缓缓解解小小鼠鼠肥肥胖胖单独用大于30万Da的灵芝粗提物喂养高脂饮食小鼠，与直接喂食灵芝水提物效
20、果类似。采集统计多项生理生化指标灵芝水提物对高脂饮食小鼠体重等指标的影响55灵芝水提物对高脂饮食小鼠肝脏重量等指标的影响56灵芝水提物对高脂饮食小鼠白介素等基因表达的影响57灵芝水提物对高脂饮食小鼠白介素等基因表达的影响58灵芝水提物对高脂饮食小鼠肌动蛋白等丰度的影响59灵芝水提物对高脂饮食小鼠肠道菌群谱的影响60灵芝水提物对高脂饮食小鼠肠道菌群谱的影响61灵芝水提物对高脂饮食小鼠肠道菌群谱的影响62灵芝水提物对高脂饮食小鼠肠道菌群谱的影响.63移植不同来源的粪便对肥胖小鼠体重等指标的影响64移植不同来源的粪便对肥胖小鼠白介素等基因表达的影响65移植不同来源的粪便对肥胖小鼠白介素等基因表达及翻译的影响66移植不同来源的粪便对肥胖小鼠肠道菌群谱的影响67移植不同来源的粪便对肥胖小鼠肠道菌群谱的影响68移植不同来源的粪便对肥胖小鼠肠道菌群谱的影响69移植不同来源的粪便对肥胖小鼠肠道菌群谱的影响707172灵芝水提物不同分子量组分对肥胖小鼠体重等指标的影响73灵芝水提物不同分子量组分对肥胖小鼠肝脏重量等指标的影响74
