1、实验三、实验三、叶绿体色素含量的测定（分光光度法叶绿体色素含量的测定（分光光度法 和和SPADSPAD叶绿素仪法叶绿素仪法）高等植物在光合反应中吸收光能的主要色素为叶绿素,其含 有的叶绿素 a和叶绿素 b能将光能转化为化学能,形成有机物质。因此,叶片中叶绿素含量的高低是反映植物叶片光合能力的一个重要指标。一、目的:了解分光光度计和SPAD叶绿素仪的使用方法；理解分光光度计测定叶绿体色素含量的实验原理；掌握计算叶绿体各色素成分含量的方法。要求：2、问答题：（1）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其数学表定律又叫什么定律？列出其数学表达式（并说明各符号的代表意义）。达式（并说明各符号的
2、代表意义）。Lambert-Beer 定律中的比例系数定律中的比例系数“K”的物理意义是的物理意义是？Lambert-Beer 定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？（2）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰,为何为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？（3）本实验为什么要用光路宽度为）本实验为什么要用光路宽度为1cm的比色杯？的比色杯？二、原理 叶绿素提取液中同时含有叶绿素叶绿素提取液中同时含有叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b,b,二者的吸收光谱虽有不同二者的吸收
3、光谱虽有不同,但又存在着明显的重叠但又存在着明显的重叠（如图）（如图）,在不在不分离叶绿素分离叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的情况下同时测的情况下同时测定叶绿素定叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的浓度的浓度,可分别测可分别测定在定在665nm665nm和和649nm649nm的光吸收的光吸收,由于在由于在该波长时叶绿素该波长时叶绿素a a、b b的比吸收系数的比吸收系数K K为为已知，我们即可以根据已知，我们即可以根据Lambert-BeerLambert-Beer定律定律,列出浓度列出浓度C C与光密度与光密度D D之间的关系之间的关系式：式：D D665665=83.31Ca+18.
4、60Cb=83.31Ca+18.60Cb.(1).(1)D D649649=24.54Ca+44.24Cb=24.54Ca+44.24Cb.(2).(2)从而计算出提取液中叶绿素从而计算出提取液中叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的浓度的浓度.叶绿素a、b的比吸收系数波长波长(nm)叶绿素叶绿素a叶绿素叶绿素b66583.3118.60649 24.5444.24注：注：(1)(2)式中的式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长为叶绿素溶液在波长665nm和和649nm时时的光密度。叶绿素的光密度。叶绿素a、b的浓度单位为：的浓度单位为：g/L 解方程式解方程式(1)(2)(1)(2)，则得
5、：，则得：Ca=13.7 DCa=13.7 D6656655.76D5.76D649649 (3)(3)Cb=25.8 DCb=25.8 D6496497.6 D7.6 D665665.(4).(4)G G总总=Ca+Cb=6.10D=Ca+Cb=6.10D665665+20.04D+20.04D649649(5)(5)注：此时，此时，Ca、Cb为叶绿素为叶绿素a、b浓度，单位为浓度，单位为:mg/L，利用上面（，利用上面（3）（）（4）(5)式，即可以计算叶绿素式，即可以计算叶绿素a、b含量及总叶绿素的总含量含量及总叶绿素的总含量(G总)。二、材料：大红花老叶和嫩叶 三、实验步骤 1.1.取
6、新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2.2.称取剪碎的新鲜样品称取剪碎的新鲜样品0.5g0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙，放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及和石英砂及2 23ml953ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml10ml，暗，暗处静置处静置3 35min5min。3.3.取滤纸取滤纸1 1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到入漏斗中，过滤到25ml25ml棕色容
7、量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4.4.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml25ml，摇匀。，摇匀。5.5.把叶绿体色素提取液把叶绿体色素提取液稀释稀释5 5倍倍后倒入后倒入光径光径1cm1cm的比色杯内。的比色杯内。以以9595乙醇为参比，在波长乙醇为参比，在波长665nm665nm、649nm649nm下测定
8、光密度。下测定光密度。四、实验结果计算四、实验结果计算 将测定得到的吸光值代入下面的式子：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.7 D6655.76D649(3)Cb=25.8 D6497.6 D665.(4)G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649(5)分别计算叶绿素分别计算叶绿素a a、b b和总叶绿素的含量和总叶绿素的含量ChlChl（mg/g.FWmg/g.FW）=样品鲜重稀释倍数提取液体积叶绿素的浓度1000开机调零测量1测量2测量3求平均值一一 分光光度计的工作原理：分光光度计的工作原理：分光光度计采用一个可以产生分光光度计采用一个可以产生多个波多个波长长的的
9、光源光源，通过系列分光装置，从而产生，通过系列分光装置，从而产生特定波长特定波长的的光源光源，光源透过测试的样品后，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。而转化成样品的浓度。样品的样品的吸光值吸光值与与样样品的浓度品的浓度成成正比正比。二二 分光光度计的基本常识：分光光度计的基本常识：1 1、紫外光分光光度计，其使用、紫外光分光光度计，其使用波长在波长在190190400nm,400nm,可见光分光光度计，其使用可见光分光光度计，其使用波长在波长在400400800nm800nm。2 2 消光系数：消光系数：是溶液对光
10、吸收的比例常数，指在一定的是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K K表示。它取表示。它取决于溶质性质、入射光波长和温度。决于溶质性质、入射光波长和温度。消光度消光度（也叫光密度（也叫光密度ODOD，或吸光值，或吸光值A A）：表示溶液吸收）：表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也用光的强弱或吸收程度，也用E E表示。表示。E E值愈大，溶液对光值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。吸收的程度愈大。透光率（透光率（用用T表示）表示）：是透射光强度（透过比色皿）是透射光强度（透过比色皿）与入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比与入
11、射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（用（用T=It/I0表示）表示）。三、三、分光光度计的基本维护及使用注意事项：分光光度计的基本维护及使用注意事项：1 1 分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。2 2 分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。3 3 仪器连续使用时间不应超过仪器连续使用时间不应超过2 2小时，小时，每次使用需歇半小每次使用需歇半小时以上才能再用。用完仪器后，务必关避电源开关，拔下时以上才能再用。用完仪
12、器后，务必关避电源开关，拔下插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。4 4 千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯的光滑面比色杯的光滑面。不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。5 5 盛待液时，必须达到比色杯的盛待液时，必须达到比色杯的2/32/3左右，不宜过多。用左右，不宜过多。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。6 6 每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。每套分光光度计上的比色杯及比
13、色槽不得随意更换。7 7 测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，再选择再选择最大峰的波长作为测定的波长最大峰的波长作为测定的波长。一般所制成的溶液。一般所制成的溶液应应尽量使光密值在尽量使光密值在0.10.10.70.7的范围内的范围内测定。测定。VIS-723N可见分光光度计 比色皿校正和多波长测定比色皿校正和多波长测定 操作步骤：1.在主菜单下选择“2光度测量”主菜单1波长扫描2光度测量3定量分析4时间扫描5实时测量6系统设置3.比色皿配对完成后，按比色皿配对完成后，按“RETURN”键退键退回光度测量参数设置界面。回光度测量参数设
14、置界面。4.按按F2开始测量。可按照屏幕上的提示进行开始测量。可按照屏幕上的提示进行测量操作，当有多个样品需要测量时，可测测量操作，当有多个样品需要测量时，可测完一个后再按完一个后再按“F2”测下一个。注意样品的测下一个。注意样品的编号编号N值必须和比色皿的编号一致。值必须和比色皿的编号一致。2.按按“F1”进行比色皿的校正，输入进行比色皿的校正，输入除参比杯外的比色杯个数后按除参比杯外的比色杯个数后按“ENTER”键，再按键，再按“F2”，根据仪，根据仪器提示进行操作即可。器提示进行操作即可。AM-300手持式叶面积仪测定叶面积手持式叶面积仪测定叶面积原理：原理：内置固体标准光源的CCD扫描
15、系统 开机,按住电源开关1秒 选择显示方向 放入材料（不能直接接触探头）按住探头上红色button,直至发出两种连续蜂鸣,屏幕提示“measure”可开始测量 探头从材料上方匀速滑过，等屏幕显示出完整叶片形状后再次按红色button结束测量 植物叶面积的测定（画纸称重法）植物叶面积的测定（画纸称重法）将所测叶片放在厚度均匀的称量纸上，用铅笔将叶形画好，剪下所画的纸叶，在电子天平上称重，记为W1；另取10*10cm2的纸片，称重记为W2；则所测叶片面积X可按下面公式计算出。X（cm2）W1/W2100CB-1102便携式光合蒸腾测定仪特点：非破坏性测量，即不离体测量 具有开路和闭路测量两种光合测量方式 可以手动或自动测量，可编程自动定时测量 全部测量参数和计算结果可以存贮，并通过 RS232接口传输到计算机 原理：利用红外CO2分析器和湿度传感器对参考气和流经叶室后的测量气进行测量，根据CO2浓度差和湿度差以及流量等参数，利用气体通量公式，分别计算净光合（或呼吸）速率和蒸腾速率。仪器中使用的参数：a温度 CO2i室内CO2浓度 CO2o室外CO2浓度 RHi室内相对含水量 RHo室外相对含水量 PA光合有效辐照度 净光合速率 蒸腾速率 CO2int 胞间CO2浓度
