1、第七章 寄生虫病诊断第一节 病原学诊断方法一、粪便虫卵检查法一、粪便虫卵检查法1.1.直接涂片法直接涂片法 direct smear method direct smear method 2.2.漂浮集卵法漂浮集卵法 flotation method flotation method 3.3.沉淀集卵法沉淀集卵法 sedimentation methodsedimentation method4.4.麦氏计数法麦氏计数法 MacMaster MacMaster methodmethod5.5.毛蚴孵化法毛蚴孵化法 是诊断日本血吸虫及东毕吸虫的方法是诊断日本血吸虫及东毕吸虫的方法之一。之一。6.
2、6.粪便培养与幼虫分离法粪便培养与幼虫分离法圆线虫目所属线虫种类圆线虫目所属线虫种类很多很多，其虫卵在形态上非常，其虫卵在形态上非常相似相似，很难区别。有时，很难区别。有时为了为了区别这些线虫的种类区别这些线虫的种类，常，常将含有虫卵的粪便将含有虫卵的粪便加以培养加以培养，待其中虫卵发育，待其中虫卵发育成为成为幼幼虫时再检查，根据幼虫形态上的差异，加以鉴别。虫时再检查，根据幼虫形态上的差异，加以鉴别。最常用的方法是在最常用的方法是在培养皿培养皿底部加草纸或滤纸底部加草纸或滤纸1 1张张，而，而后将欲培养的后将欲培养的粪便粪便加水调成硬糊状，加水调成硬糊状，塑成塑成半球形，放半球形，放于皿内于皿
3、内的纸的纸上，并使半球形粪上，并使半球形粪球的球的顶部略高出平皿边顶部略高出平皿边沿沿，使，使加盖时与皿盖相接触。加盖时与皿盖相接触。将此皿置将此皿置2525温箱中，温箱中，注意保持注意保持皿内湿度（应使底部皿内湿度（应使底部的垫的垫纸保持潮湿状态）。经纸保持潮湿状态）。经7 7天后天后，多数虫卵即可发，多数虫卵即可发育育成第三成第三期幼虫，并集中于皿期幼虫，并集中于皿盖上盖上的水滴中。将幼虫的水滴中。将幼虫吸出吸出置载玻片置载玻片上，放显微镜下上，放显微镜下检查。检查。有些寄生虫（如网尾科线虫），其虫卵在新排出的有些寄生虫（如网尾科线虫），其虫卵在新排出的粪便中已孵化为幼虫；类圆属线虫虫卵随
4、粪便排出后，粪便中已孵化为幼虫；类圆属线虫虫卵随粪便排出后，在外界温度较高时，经在外界温度较高时，经5-125-12 h h即孵出幼虫。为了提高即孵出幼虫。为了提高检出率，常将幼虫从粪便中分离出来进行检查。检出率，常将幼虫从粪便中分离出来进行检查。常用的方法为常用的方法为漏斗漏斗幼虫分离幼虫分离法法 亦称亦称贝尔曼法贝尔曼法 (Baermanns(Baermanns technique)technique)7.7.测微技术测微技术各种虫卵和幼虫，大小通常较为恒定。虫卵或幼虫的各种虫卵和幼虫，大小通常较为恒定。虫卵或幼虫的大小可作为确定某一虫卵或幼虫的依据。虫卵和幼虫大小可作为确定某一虫卵或幼虫
5、的依据。虫卵和幼虫的测量需用测微器。的测量需用测微器。长长1mm的直的直线等分为线等分为100小格小格,每小格每小格等于等于10 m10倍物镜，标定后倍物镜，标定后每小格是多少？每小格是多少？1 m二、体表虫体检查法寄生于动物体表的寄生于动物体表的寄生虫主要寄生虫主要有蜱、螨、虱等。对有蜱、螨、虱等。对于于它们的检查，可采用它们的检查，可采用肉眼肉眼观察和显微镜观察相结观察和显微镜观察相结合合的方法。的方法。蜱寄生于动物体表，蜱寄生于动物体表，个体较大个体较大，通过肉眼观察即，通过肉眼观察即可发现可发现。螨和虱有些个体较小，螨和虱有些个体较小，常需常需刮取皮屑，于显微镜刮取皮屑，于显微镜下寻找
6、下寻找虫体或卵。虫体或卵。三、生殖道虫体检查寄生于生殖道的虫体寄生于生殖道的虫体主要有主要有牛胎儿三毛滴虫牛胎儿三毛滴虫和马和马媾疫媾疫锥虫锥虫牛胎儿毛滴虫存在于牛胎儿毛滴虫存在于病母牛病母牛的阴道或子宫的的阴道或子宫的分泌分泌物物，流产胎儿的羊水，流产胎儿的羊水、羊膜、羊膜或其第四胃内容或其第四胃内容物中物中，也存在于公牛的也存在于公牛的包皮包皮鞘内，应采集以上鞘内，应采集以上各处各处的病料的病料寻找虫体。寻找虫体。由于虫体的检定常以由于虫体的检定常以见到见到运动活泼的虫体为准运动活泼的虫体为准，故，故在在采集病料时必须采集病料时必须尽可能尽可能地避免污染，以免地避免污染，以免其它鞭毛虫其它
7、鞭毛虫混混入病料造成误诊入病料造成误诊。采集。采集用的器皿和冲洗液用的器皿和冲洗液等应等应加热使接加热使接近体温，近体温，否则虫体否则虫体骤然遇冷会失去骤然遇冷会失去活动力活动力或死亡。或死亡。冲洗液应采用以玻璃蒸馏装置制备的蒸馏水配制生理冲洗液应采用以玻璃蒸馏装置制备的蒸馏水配制生理盐水，以保证冲洗液中不含金属离子，减少金属离子盐水，以保证冲洗液中不含金属离子，减少金属离子对虫体的影响。病料采集后应尽快地进行检查。对虫体的影响。病料采集后应尽快地进行检查。由母畜采集病料，是取由母畜采集病料，是取阴道阴道分泌的透明粘液，以分泌的透明粘液，以直接直接自阴道内采取为良好自阴道内采取为良好，建议，建
8、议用一根长用一根长4545厘米，厘米，直径直径1.01.0厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，在距在距一端的一端的1212厘米处，弯厘米处，弯成成150150角，而后消毒备用。角，而后消毒备用。使用时将管的使用时将管的“短臂短臂”插入受检畜的阴道，另端接插入受检畜的阴道，另端接一橡皮管并抽吸，少量阴道粘液即可吸入管内。取一橡皮管并抽吸，少量阴道粘液即可吸入管内。取出玻管，两端塞以棉球，带回实验室检查。出玻管，两端塞以棉球，带回实验室检查。收集公牛包皮冲洗液，收集公牛包皮冲洗液，应先应先准备准备100-150100-150毫升毫升加加温到温到30-3530-35的生理盐水的生理盐水，用，用针筒注入包皮腔
9、。用针筒注入包皮腔。用手指手指将包皮口捏紧，用另将包皮口捏紧，用另一手一手按摩包皮后部，而后按摩包皮后部，而后放松放松手指，将液体收集于手指，将液体收集于广口广口瓶中待查。瓶中待查。流产胎儿，可取其流产胎儿，可取其第四胃第四胃内容物，胸水或腹水内容物，胸水或腹水检查检查。检查时应将收集到的病料检查时应将收集到的病料，立即，立即放于载玻片上，并放于载玻片上，并防防止止材料干燥。对浓稠的材料干燥。对浓稠的阴道阴道粘液，检查前最好以粘液，检查前最好以生理盐生理盐水水稀释稀释2-32-3倍，羊水倍，羊水或包皮或包皮洗涤物最好先以洗涤物最好先以每分钟每分钟20002000转的速度离心转的速度离心沉淀沉淀
10、5 5分钟，而后以沉淀物分钟，而后以沉淀物制片检查制片检查。未染色的标本主要检查活动的虫体，在显微镜下可见未染色的标本主要检查活动的虫体，在显微镜下可见其长度略大于一般的白细胞，能清楚地见到波动膜，其长度略大于一般的白细胞，能清楚地见到波动膜，有时尚可见到鞭毛，在虫体内部可见含有一个圆形或有时尚可见到鞭毛，在虫体内部可见含有一个圆形或椭圆形的有强折光性的核。椭圆形的有强折光性的核。波动膜常作为本虫与其它一些非致病性鞭毛虫和波动膜常作为本虫与其它一些非致病性鞭毛虫和纤毛虫在形态上相区别的依据。也可将标本固定，纤毛虫在形态上相区别的依据。也可将标本固定，用姬氏染液或苏木素染色后检查。用姬氏染液或苏
11、木素染色后检查。马媾疫锥虫在末梢血液马媾疫锥虫在末梢血液中很少中很少出现，因出现，因此血液学此血液学检查检查在马媾疫诊断上的在马媾疫诊断上的用处不大用处不大。检查材料主要应检查材料主要应采取采取浮肿部皮肤或丘疹的浮肿部皮肤或丘疹的抽出抽出液，尿道及阴道的液，尿道及阴道的粘膜刮粘膜刮取物，特别取物，特别在粘膜刮在粘膜刮取物取物中最易发现虫体。中最易发现虫体。采取病料时，浮肿液和采取病料时，浮肿液和皮肤皮肤丘疹液用消毒的注射器丘疹液用消毒的注射器抽取抽取，为了防止吸入，为了防止吸入血液发生血液发生凝固，可于凝固，可于注射器注射器内内先先吸入适量的吸入适量的 抗凝剂（抗凝剂（2%2%柠檬酸钠生理盐水
12、）。柠檬酸钠生理盐水）。马阴道粘膜刮取物的采取，先用阴道扩张器扩张阴马阴道粘膜刮取物的采取，先用阴道扩张器扩张阴道，再用长柄锐匙在其粘膜道，再用长柄锐匙在其粘膜有炎症有炎症的部位刮取，刮的部位刮取，刮时时应稍应稍用力，使刮取物微带血液，则其中容易检到用力，使刮取物微带血液，则其中容易检到锥虫。锥虫。采取公马尿道刮取物时，应先将马保定，左手伸入采取公马尿道刮取物时，应先将马保定，左手伸入包皮内，以食指插入龟头窝中，徐徐用力以牵出阴包皮内，以食指插入龟头窝中，徐徐用力以牵出阴茎，用消毒的长柄锐匙插入尿道内，刮取病料。茎，用消毒的长柄锐匙插入尿道内，刮取病料。以上所采的病料，均可以上所采的病料，均可
13、加适量加适量的生理盐水，置载的生理盐水，置载玻玻片上，覆以盖玻片，片上，覆以盖玻片，制制 成成压滴标本检查；也可压滴标本检查；也可制制成成抹片，用姬氏液染色抹片，用姬氏液染色后检查后检查。也可用灭菌纱布，以也可用灭菌纱布，以生理盐水生理盐水浸湿，用敷料钳浸湿，用敷料钳夹持夹持，插入，插入公马尿道或母马阴道公马尿道或母马阴道，擦洗，擦洗后，取出后，取出纱布，洗纱布，洗入无菌入无菌生理盐水中，将生理盐水中，将盐水离心盐水离心沉淀，沉淀，取沉淀物检查取沉淀物检查，方法，方法同上。同上。四、血液和组织内虫体检查法1.1.鲜血压滴标本检查鲜血压滴标本检查2.2.涂片染色标本检查涂片染色标本检查 3.3.
14、虫体浓集法虫体浓集法涂片法虽然可以查到涂片法虽然可以查到血液中血液中的原虫，但血液中的的原虫，但血液中的虫体虫体较少时，则不易查出较少时，则不易查出虫体虫体。为此常先进行集虫，。为此常先进行集虫，再再制片检查。其操作制片检查。其操作过程是过程是采病畜抗凝血采病畜抗凝血6-76-7毫升，毫升，以以每分钟每分钟500500转的速度转的速度离心离心5 5分钟，使其中大部分红分钟，使其中大部分红细胞细胞沉降。沉降。而后将含有少量红细胞，白细胞和虫体的上层血浆移而后将含有少量红细胞，白细胞和虫体的上层血浆移入另一离心管中，补加一些生理盐水，以每分钟入另一离心管中，补加一些生理盐水，以每分钟2500250
15、0转的速度离心转的速度离心1010分钟。取沉淀物制成抹片，按上述染分钟。取沉淀物制成抹片，按上述染色法染色检查。此法适用于伊氏锥虫病和梨形虫病。色法染色检查。此法适用于伊氏锥虫病和梨形虫病。其原理是锥虫和感染有其原理是锥虫和感染有梨形梨形虫的红细胞较正常红细虫的红细胞较正常红细胞的比重为轻，所以在胞的比重为轻，所以在第一次第一次沉淀时，正常红细胞沉淀时，正常红细胞下降，而锥虫和感染有下降，而锥虫和感染有梨形梨形虫的红细胞尚悬浮在血虫的红细胞尚悬浮在血浆中。第二次离心沉淀时，则将其浓集于管底。浆中。第二次离心沉淀时，则将其浓集于管底。对于血液中的微丝蚴，也可用虫体浓集法。对于血液中的微丝蚴，也可
16、用虫体浓集法。方法是采血于离心管中。加入方法是采血于离心管中。加入5%5%醋酸溶液以醋酸溶液以溶血。待溶血完成后，离心并吸取沉淀检查。溶血。待溶血完成后，离心并吸取沉淀检查。4.4.组织内虫体检查法组织内虫体检查法有些原虫可以在动物身体有些原虫可以在动物身体的不同的不同组织内寄生。一组织内寄生。一般在般在死后死后剖检时，取一小块组织剖检时，取一小块组织，以，以其切面在载玻其切面在载玻片上做成片上做成抹片抹片、触片触片，或将小块组织，或将小块组织固定固定后制成组后制成组织切片，染色织切片，染色检查检查。抹片或触片可用。抹片或触片可用瑞氏染色瑞氏染色法或法或姬氏染液染色。姬氏染液染色。泰勒虫感染的
17、病畜常呈现局部体泰勒虫感染的病畜常呈现局部体表淋巴结肿大。取表淋巴结肿大。取淋巴结穿刺物淋巴结穿刺物，进行显微镜检查以寻找病原体，对进行显微镜检查以寻找病原体，对本病的早期诊断很有帮助。其方法本病的早期诊断很有帮助。其方法是，首先将病畜保定，用右手将肿是，首先将病畜保定，用右手将肿大的淋巴结稍向上方推移，并用左大的淋巴结稍向上方推移，并用左手固定淋巴结。手固定淋巴结。局部剪毛，消毒，以局部剪毛，消毒，以1010毫升毫升注射器和较粗的针头刺注射器和较粗的针头刺入淋巴结，抽取淋巴组织；拔出针头，将针头内容入淋巴结，抽取淋巴组织；拔出针头，将针头内容物推挤物推挤到载玻片上，涂成抹片，固定，染色，镜检
18、，到载玻片上，涂成抹片，固定，染色，镜检，可以找到柯赫氏蓝体。可以找到柯赫氏蓝体。家畜患弓形虫病时，除家畜患弓形虫病时，除死后死后可在一些组织中找到可在一些组织中找到包囊包囊和速殖子外，生前和速殖子外，生前诊断可取诊断可取腹水，检查其中腹水，检查其中滋滋养体养体的存在。收集腹水，的存在。收集腹水，猪只猪只可采取侧卧保定，可采取侧卧保定，穿穿刺部刺部在白线下侧脐的在白线下侧脐的后方（后方（公畜）或前方（母畜）公畜）或前方（母畜）1-21-2厘米处。厘米处。穿刺时先局部消毒，将皮肤推向一侧，穿刺时先局部消毒，将皮肤推向一侧，针头以略倾斜的方向向下刺入，深度约针头以略倾斜的方向向下刺入，深度约2-4
19、2-4厘米，针头刺入腹腔后会感到阻力骤厘米，针头刺入腹腔后会感到阻力骤减，而后有腹水流出。取得的腹水可在减，而后有腹水流出。取得的腹水可在载玻片上抹片，以瑞氏液或姬氏液染色载玻片上抹片，以瑞氏液或姬氏液染色后后检查。检查。肌肉中旋毛虫的检查，肌肉中旋毛虫的检查，是肉是肉品卫生检验的重要项目，品卫生检验的重要项目，世界世界各国使用的方法各国使用的方法大同小异大同小异。传统的方法为镜检。传统的方法为镜检法法，但目前多用消化法。，但目前多用消化法。镜检法为取膈肌肉样镜检法为取膈肌肉样0.51g0.51g，剪成，剪成3 310mm10mm的小块，的小块，用用厚玻片压紧，放厚玻片压紧，放显微镜显微镜下检
20、查。下检查。消化法为取消化法为取100g100g肉样，搅肉样，搅碎或碎或剪碎，放入剪碎，放入3L3L的烧瓶的烧瓶内内。加入。加入10g10g胃蛋白酶和胃蛋白酶和2L2L自来水自来水。然后加入。然后加入16ml16ml盐盐酸（酸（25%25%），放入），放入1 1磁力磁力搅拌棒搅拌棒。置于可加热的磁力。置于可加热的磁力搅搅拌器拌器上，设温于上，设温于44464446。30min30min后后,将消化液用将消化液用180m180m的滤筛滤入一的滤筛滤入一2L2L的分离的分离漏斗漏斗,静置静置30min,30min,放出放出40ml40ml液体于一液体于一50ml50ml的量筒内的量筒内,静置静置1
21、0min,10min,吸去吸去30ml30ml上清夜。上清夜。加入加入30ml30ml水，摇匀。水，摇匀。10min10min后，再吸去后，再吸去30ml30ml上清液。上清液。剩下的液体到入一带有格线的平皿内，用剩下的液体到入一带有格线的平皿内，用20-5020-50倍显倍显微镜观察。微镜观察。五、动物接种法1.1.伊氏锥虫伊氏锥虫 试验试验动物可用小鼠、大鼠动物可用小鼠、大鼠、豚鼠、豚鼠、兔或、兔或犬。其中犬。其中尤以尤以小鼠小鼠最适用。接种材料最适用。接种材料用用可疑病可疑病畜的抗凝血液，血液畜的抗凝血液，血液采取后采取后应在应在2-42-4小时内接种完毕小时内接种完毕。接种量。接种量0
22、.5-0.5-1.01.0毫升，可毫升，可接种于接种于腹腔或皮下。腹腔或皮下。接种后的动物应隔离并经常检查。当病料中含虫较多时，接种后的动物应隔离并经常检查。当病料中含虫较多时，小鼠在接种后小鼠在接种后1-31-3日即可在其外周血液中查到锥虫，当病日即可在其外周血液中查到锥虫，当病料内含虫量少时，发病时间可能延长，因此接种后至少观料内含虫量少时，发病时间可能延长，因此接种后至少观察一个月。也可于接种的第察一个月。也可于接种的第3 3天采天采接种小鼠的血液接种小鼠的血液0.51.00.51.0毫升毫升，接种于另一只小鼠，如此盲传，接种于另一只小鼠，如此盲传3 3代，即可在代，即可在接种小接种小鼠
23、外周血内发现虫体鼠外周血内发现虫体。2.2.马媾疫马媾疫 马马媾疫锥虫不能接种于多数实验动物，但可将媾疫锥虫不能接种于多数实验动物，但可将病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水混合，病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水混合，接种于公家兔的睾丸实质中，每个睾丸的接种量接种于公家兔的睾丸实质中，每个睾丸的接种量为为0.20.2毫升毫升。如有马媾疫锥虫存在，经如有马媾疫锥虫存在，经1-21-2周周后，即可见家兔后，即可见家兔的阴囊、阴茎、睾丸以及耳、唇的阴囊、阴茎、睾丸以及耳、唇周围周围的皮肤发生的皮肤发生水肿，并水肿，并可在可在水肿液内检出虫体。水肿液内检出虫体。3.3.胎儿毛滴虫胎儿毛滴虫 取病牛
24、阴道分泌物或包皮冲洗液为病料，接种取病牛阴道分泌物或包皮冲洗液为病料，接种于妊娠豚鼠的腹腔内，在接种后于妊娠豚鼠的腹腔内，在接种后1-201-20天可以使妊娠天可以使妊娠豚鼠发生流产，在其流产胎儿的消化道和胎盘里可豚鼠发生流产，在其流产胎儿的消化道和胎盘里可查出大量的毛滴虫。查出大量的毛滴虫。4.4.弓形虫弓形虫 弓形虫是多宿主病原原虫，多种家畜和实验动物均弓形虫是多宿主病原原虫，多种家畜和实验动物均具有易具有易感性，但小鼠对之特别敏感，常常仅数十个虫感性，但小鼠对之特别敏感，常常仅数十个虫体即体即可使可使小鼠感染发病。小鼠感染发病。一般取急性死亡的可疑一般取急性死亡的可疑动物的动物的肺、淋巴
25、结、脾、肝或肺、淋巴结、脾、肝或脑组织脑组织，以，以1:51:5的比例加入的比例加入生理盐水生理盐水，制成乳剂，并加，制成乳剂，并加少量少量青霉素和链霉素以控制青霉素和链霉素以控制细菌细菌感染。感染。吸取乳剂吸取乳剂0.20.2毫升接种于小鼠腹腔，一般急性者在毫升接种于小鼠腹腔，一般急性者在4-54-5天后发病。病鼠被毛粗乱，食欲消失，腹部膨天后发病。病鼠被毛粗乱，食欲消失，腹部膨大，有大量腹水，病程大，有大量腹水，病程4-54-5天，最后死亡。抽取病天，最后死亡。抽取病鼠或病死鼠的腹水作涂片，染色检查，可见大量鼠或病死鼠的腹水作涂片，染色检查，可见大量游离的滋养体。游离的滋养体。六、动物剖检
26、法1.1.全身剖检法全身剖检法在动物死亡（或捕杀）后在动物死亡（或捕杀）后，首先首先制作血片，染色检制作血片，染色检查查，观察，观察血液中有无寄生虫血液中有无寄生虫，而后，而后仔细检查体表，观察仔细检查体表，观察有有无体表寄生虫无体表寄生虫。而后剥皮，观察而后剥皮，观察皮下组织中皮下组织中有无虫体寄生。有无虫体寄生。将各内部脏器依次取出将各内部脏器依次取出，先，先收集胸水，腹水，收集胸水，腹水，沉沉淀淀后观察其中有无后观察其中有无寄生虫寄生虫。而后取出全部。而后取出全部消化器官消化器官及其所附的肝、及其所附的肝、胰等胰等腺体。取出呼吸系统腺体。取出呼吸系统、泌尿系、泌尿系统统和生殖系统和生殖系
27、统、心脏、心脏和大的动脉和和大的动脉和静脉血管静脉血管，分别，分别进行检查。进行检查。l 消化系统消化系统 先先将附着其上的肝、胰取下，再将食道、胃将附着其上的肝、胰取下，再将食道、胃（反刍兽应将四个胃分开）、小肠、大肠、盲肠（反刍兽应将四个胃分开）、小肠、大肠、盲肠分别结扎后分离。分别结扎后分离。l 呼吸器官呼吸器官 用剪刀将鼻、喉、气管、支气管切开，寻找用剪刀将鼻、喉、气管、支气管切开，寻找虫体虫体。用。用小刀刮气管粘膜，刮小刀刮气管粘膜，刮下物下物在解剖镜下检在解剖镜下检查。肺查。肺组织组织按肝脏处理方法。按肝脏处理方法。l泌尿器官泌尿器官 切开肾，先对肾盂作肉眼检查，再刮取肾盂粘膜切开
28、肾，先对肾盂作肉眼检查，再刮取肾盂粘膜检查。最后将肾实质切成薄片，压于两玻片间，在放检查。最后将肾实质切成薄片，压于两玻片间，在放大镜或解剖镜下检查。剪开输尿管，膀胱和尿道，检大镜或解剖镜下检查。剪开输尿管，膀胱和尿道，检查其粘膜，并注意粘膜下有无包囊。收集尿液，用反查其粘膜，并注意粘膜下有无包囊。收集尿液，用反复沉淀法处理。复沉淀法处理。l 生殖器官生殖器官 切开并刮取粘膜，压片检查。怀疑为马媾疫切开并刮取粘膜，压片检查。怀疑为马媾疫和牛胎儿毛滴虫病时，应涂片染色后油镜检查。和牛胎儿毛滴虫病时，应涂片染色后油镜检查。l 脑脑 先肉眼检查有无多头蚴，再切成薄片，压片检查先肉眼检查有无多头蚴，再
29、切成薄片，压片检查l 眼眼 结膜和结膜腔以括搔结膜和结膜腔以括搔法处理法处理检查。剖开眼球，将检查。剖开眼球，将前房水收集于皿中，在前房水收集于皿中，在放大镜放大镜下检查。下检查。l 心和主要血管心和主要血管 剖开将内容物洗于生理盐水中，反复用沉淀法检剖开将内容物洗于生理盐水中，反复用沉淀法检查（对血管内分体吸虫的收集见后）。查（对血管内分体吸虫的收集见后）。l 膈脚膈脚 特别是猪，应用镜检法和消化法进行检查。特别是猪，应用镜检法和消化法进行检查。2.2.个别器官和个别个别器官和个别寄生虫剖寄生虫剖检法检法有时为了特定的目的，仅有时为了特定的目的，仅对某对某一器官或某一器官一器官或某一器官中的
30、中的某种某种寄生虫进行检查，如寄生虫进行检查，如调查某调查某一地某一器官一地某一器官中寄生虫中寄生虫寄生寄生的情况，或调查某一的情况，或调查某一地区某种地区某种寄生虫寄生虫的流行情况，的流行情况，或考核或考核某一药品对某种某一药品对某种寄生虫的寄生虫的驱虫驱虫效果。其剖检方法同全身剖检法效果。其剖检方法同全身剖检法。第二节 免疫学诊断方法免疫学诊断免疫学诊断：应用：应用免疫学免疫学的理论、技术和方法的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态。诊断各种疾病和测定免疫状态。抗原抗体反应抗原抗体反应T细胞杀伤反应细胞杀伤反应补体介导的反应补体介导的反应已已报道的寄生虫免疫学报道的寄生虫免疫学诊断方
31、法诊断方法很多，包括变态反应、很多，包括变态反应、沉淀反应、凝集反应、沉淀反应、凝集反应、补体结合试验补体结合试验，免疫荧光抗体，免疫荧光抗体技术、免疫酶技术、技术、免疫酶技术、放射免疫分析放射免疫分析技术、免疫印迹技技术、免疫印迹技术等。此处仅介绍主要术等。此处仅介绍主要几种。几种。一、间接血凝试验一、间接血凝试验1.1.基本原理基本原理 间接血凝试验间接血凝试验(Indirect heamagglutination assay(Indirect heamagglutination assay，IHAIHA)是将是将可溶性抗原或抗体先吸附可溶性抗原或抗体先吸附于于红细胞红细胞表面表面，然后，
32、然后与与相应的抗体相应的抗体或抗原作用，在适宜的条件下由于抗原抗或抗原作用，在适宜的条件下由于抗原抗体的特异性结合，会体的特异性结合，会带动带动红细胞红细胞的的凝集，出现肉眼可见凝集，出现肉眼可见的凝集现象，称的凝集现象，称间接血凝试验。间接血凝试验。红细胞自然红细胞自然沉降，阴性沉降，阴性被致敏的红细胞被致敏的红细胞与被检血清反应，与被检血清反应，形成复合物，而形成复合物，而不沉降，阳性不沉降，阳性（1 1）用微量滴管加）用微量滴管加4 4滴（滴（2525l/l/滴）生理盐水于滴）生理盐水于U U型微量血凝板第一排型微量血凝板第一排第二孔内，第三孔空白，第四孔加第二孔内，第三孔空白，第四孔加
33、1 1滴滴。（2 2）第一孔内加）第一孔内加待检血清待检血清，混匀，从中吸取血清，混匀，从中吸取血清1 1滴加入第二孔内，充滴加入第二孔内，充分混匀后吸出分混匀后吸出2 2滴，于第三孔和第四孔各加滴，于第三孔和第四孔各加1 1滴，在第四孔混匀后弃去滴，在第四孔混匀后弃去1 1滴，使第三孔和第四孔血清稀释度为滴，使第三孔和第四孔血清稀释度为1 15 5和和1 11010。（3 3）将冻）将冻干干致敏红细胞致敏红细胞用用蒸馏水稀释后，用定量吸管吸取致敏红细胞蒸馏水稀释后，用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于悬液，于第三孔第三孔和第四孔各加一滴（和第四孔各加一滴（2525l l），立即旋转震摇），立即旋
34、转震摇2min2min，室，室温下静置温下静置1h1h左右，观察结果左右，观察结果。（4 4）判读）判读标准以标准以血清大于或等于血清大于或等于1 1:1010稀释出现阳性反应判为血吸虫病稀释出现阳性反应判为血吸虫病患者患者。二、免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术(Immunofluorescence method)(Immunofluorescence method)又称荧又称荧光抗体标记技术光抗体标记技术(Fluorescent-labelled antibody(Fluorescent-labelled antibody technique)technique)，是指用荧光素对抗体或抗
35、原进行标记，是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。应的抗原或抗体的方法。判定结果时，判定结果时，-为无荧光，为无荧光，+为荧光弱但清楚可见，为荧光弱但清楚可见，+为荧光明亮，为荧光明亮，+为荧光强而明亮。为荧光强而明亮。A：+；B：+；C：:+；D：阴性：阴性对照对照目前，荧光免疫技术目前，荧光免疫技术已在已在许多寄生虫病中许多寄生虫病中得到应得到应用用。如血吸虫病。如血吸虫病、锥虫、锥虫病、旋毛虫病、病、旋毛虫病、弓形虫病弓形虫病、利什曼病等。利什曼病等。弓形虫速殖子弓形虫速殖子抗原抗原
36、片片的的制备制备用适量生理盐水用适量生理盐水稀释弓形虫速殖子全虫稀释弓形虫速殖子全虫，滴于载玻片上，显微，滴于载玻片上，显微镜下观察，至视野中的虫体均匀散在，每个高倍视野镜下观察，至视野中的虫体均匀散在，每个高倍视野100100个虫体个虫体左右（左右（1 110107 7/mL/mL）。）。用移液器吸取上述稀释好的虫体用移液器吸取上述稀释好的虫体30L30L，滴于载玻片每个反应孔，滴于载玻片每个反应孔区内，静置区内，静置30 min30 min，吸去孔区内多余的液体，空气中自然晾干，吸去孔区内多余的液体，空气中自然晾干后，冷丙酮后，冷丙酮固定固定10min10min，自然干燥，自然干燥5 51
37、0min10min，用锡纸包装后，用锡纸包装后，44保存备用。保存备用。弓形虫速殖子弓形虫速殖子免疫荧光专用载玻片免疫荧光专用载玻片将将待检待检血清血清稀释稀释后，取后，取3030LL加入抗原片反应区内，置湿盒内室加入抗原片反应区内，置湿盒内室温反应温反应3030 min min，用，用PBSPBS漂洗漂洗3 3次，每次次，每次5 5 min min，自然凉干，自然凉干。滴滴加用加用PBSPBS稀释的稀释的FITCFITC标记二抗标记二抗3030LL，湿盒内室温反应，湿盒内室温反应3030 min min，同上洗涤、晾干同上洗涤、晾干。再再加加PBSPBS稀释的伊文斯蓝（稀释的伊文斯蓝（0.0
38、2%0.02%）3030LL，湿盒内室温反应，湿盒内室温反应5 5 minmin，PBSPBS洗洗1 1次，次，5 5 min min，晾干晾干。各各反应区内滴加反应区内滴加90%90%的磷酸盐缓冲甘油一滴，覆以盖玻片，荧光的磷酸盐缓冲甘油一滴，覆以盖玻片，荧光显微镜下检查显微镜下检查。弓形虫弓形虫IFA结果结果A：一抗：一抗1:60稀释时检稀释时检测结果测结果；B：一抗：一抗1:120稀释时检稀释时检测结果测结果；C：:一抗一抗1:480稀释时稀释时检测结果检测结果；D：阴性对照检测结果：阴性对照检测结果三、免疫酶技术酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫酶与抗体或抗原结合后，既不改
39、变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗酶标抗体体-抗原复合物抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的。复合物中的酶在遇到相应的底物底物时，时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色产物的有无及其浓度有色产物的有无及其浓度，即可间接推测被检抗，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或原或抗体是
40、否存在以及其数量，从而达到定性或定量定量的目的。的目的。免疫酶技术在方法上免疫酶技术在方法上分为两分为两类，一类用于类，一类用于组织细胞中组织细胞中的抗原或抗体成分的抗原或抗体成分检测和检测和定位，称为定位，称为免疫酶免疫酶组织化学组织化学或或免疫酶染色法，免疫酶染色法，另一类另一类用于检测液体中用于检测液体中可溶性可溶性抗原抗原或抗或抗体成分体成分，称为免疫，称为免疫酶测定法。酶测定法。免疫组织化学免疫组织化学标本制备标本制备 后后，先将内源酶抑制，先将内源酶抑制，然后然后进行免疫酶染进行免疫酶染色检查色检查。其。其基本原理和方法基本原理和方法与抗体与抗体法相同，只是以酶法相同，只是以酶代替
41、代替荧光素作为标记物，荧光素作为标记物，并以并以底物产生有色产物底物产生有色产物为标为标志志。常规免疫酶。常规免疫酶染色法可分为直接和间接两种方法。染色法可分为直接和间接两种方法。l直接法直接法 是用酶标记特异性抗体，直接检测寄生虫或其是用酶标记特异性抗体，直接检测寄生虫或其抗原。在含有寄生虫或其抗原抗原。在含有寄生虫或其抗原的标本的标本固定后，消除固定后，消除其中其中的内源的内源性酶，用酶标记的性酶，用酶标记的抗体（抗体（直标一抗直标一抗）直）直接接处理，使标本中处理，使标本中的抗原的抗原与酶标抗体结合，与酶标抗体结合，然后然后加加底物显色，进行镜检。底物显色，进行镜检。l间接法间接法 是是
42、将含有寄生虫或其将含有寄生虫或其抗原的抗原的组织或细胞标本，用组织或细胞标本，用特特异性异性抗体处理，使抗原抗体结合，洗涤清除未结合的抗体处理，使抗原抗体结合，洗涤清除未结合的部分，再用酶标记的部分，再用酶标记的抗抗体抗抗体(酶标二抗酶标二抗)进行进行处理，使处理，使其形成抗原抗体其形成抗原抗体-酶标记抗抗体复合物，最后滴加底酶标记抗抗体复合物，最后滴加底物显色，进行镜检。物显色，进行镜检。间接法虽然多一步骤，但比直接法特异性强，使用范间接法虽然多一步骤，但比直接法特异性强，使用范围更广。酶标记第二抗体可用葡萄球菌围更广。酶标记第二抗体可用葡萄球菌A A蛋白蛋白SPASPA或生或生物素与亲合素
43、系统等代替，亦成功地用于许多抗原和物素与亲合素系统等代替，亦成功地用于许多抗原和抗体的检测。同时在不同程度上提高了检测方法的特抗体的检测。同时在不同程度上提高了检测方法的特异性与敏感性。异性与敏感性。免疫酶测定法分固相免疫酶测定法分固相免疫免疫酶测定法和均相酶测定法和均相免免疫酶疫酶测定法两类测定法两类l固相免疫酶测定法固相免疫酶测定法 是需用固相载体，以化学的或物理的方法将抗是需用固相载体，以化学的或物理的方法将抗原或抗体连接其上，制成免疫吸附剂，随后进行免原或抗体连接其上，制成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定。酶联免疫吸附试验疫酶测定。酶联免疫吸附试验(ELISAELISA)是固相免疫是固相
44、免疫酶测定法中应用最广泛的一种。酶测定法中应用最广泛的一种。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme(enzyme linked immunosorbent linked immunosorbent assay,assay,ELISA)ELISA)其其基本过程是将抗原基本过程是将抗原(或抗体或抗体)吸附于吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果肉眼或分光光度计判定结果。包被抗原包被抗原洗涤洗涤孵育一抗孵育一抗洗涤洗涤酶标二抗酶标二抗洗涤洗涤加底物加底物终止与显色终止与显色第三节 分子生物学诊断方法从从DNA
45、DNA双螺旋结构被发现以来，基于核酸的寄双螺旋结构被发现以来，基于核酸的寄生虫分子诊断技术就一直在飞速发展。从基于生虫分子诊断技术就一直在飞速发展。从基于DNADNA探针的探针的DNADNA印迹技术，到现在广泛应用的印迹技术，到现在广泛应用的PCRPCR技术，最新也发展了基于高通量测序、核技术，最新也发展了基于高通量测序、核酸芯片技术的方法，分子生物学诊断技术在寄酸芯片技术的方法，分子生物学诊断技术在寄生虫和寄生虫病的鉴定、诊断方面起到越来越生虫和寄生虫病的鉴定、诊断方面起到越来越重要的作用。重要的作用。一一、DNADNA印迹（印迹（Southern blotSouthern blot）转基因
46、艾美耳球虫的转基因艾美耳球虫的DNADNA印迹分析。印迹分析。转基因球虫基因组提取后用转基因球虫基因组提取后用EcoR VEcoR V,酶切，电泳分离后将酶切，电泳分离后将DNADNA转印到硝酸转印到硝酸纤维素膜膜上，然后用地高辛标记纤维素膜膜上，然后用地高辛标记的、特异性针对外源基因的、特异性针对外源基因YFPYFP的探针的探针去杂交。图中显示仅仅转基因球虫去杂交。图中显示仅仅转基因球虫具有具有YFPYFP基因特异性的杂交条带。阳基因特异性的杂交条带。阳性对照为含有性对照为含有YFPYFP基因的质粒基因的质粒DNADNA。二、二、DNADNA聚合酶聚合酶链式反应链式反应（Polymerase
47、 Polymerase chain reaction,chain reaction,PCRPCR）PCRPCR技术是在模板技术是在模板DNADNA、引物和、引物和4 4种脱氧核糖种脱氧核糖核苷酸存在核苷酸存在的条件下依赖于的条件下依赖于DNADNA聚合酶的酶促合成反应聚合酶的酶促合成反应。通过。通过20-20-3030个重复的变性、退火和延伸步骤，个重复的变性、退火和延伸步骤，DNADNA片段得到了大片段得到了大量复制，数量可达量复制，数量可达2 210106 610107 7拷贝。拷贝。PCRPCR技术的特异性取决于引物和模板技术的特异性取决于引物和模板DNADNA结合的特异性。结合的特异性
48、。材料：材料：待扩增的待扩增的样品样品（提取的含有寄生虫的基因组（提取的含有寄生虫的基因组DNADNA）引物引物：根据寄生虫特定：根据寄生虫特定DNADNA序列设计的寡核苷酸单链序列设计的寡核苷酸单链脱氧核糖核苷三磷酸脱氧核糖核苷三磷酸：分别是：分别是dATP,dATP,dTTP dCTP dGTPdTTP dCTP dGTPDNADNA聚合酶聚合酶：将特定的：将特定的脱氧核糖核苷三脱氧核糖核苷三磷酸添加到引物磷酸添加到引物33端，完成端，完成DNADNA扩增扩增酶缓冲液酶缓冲液：含有：含有MgMg2+2+等成分，用于保持聚合酶的活性。等成分，用于保持聚合酶的活性。样品样品DNA聚合酶及缓冲液聚合酶及缓冲液引物引物脱氧核糖核苷三磷酸脱氧核糖核苷三磷酸
