1、实验五：实验五：ELISAELISA法检测乙肝表面法检测乙肝表面抗原（抗原（HBsAgHBsAg）主讲人：季煜华主讲人：季煜华2014年年11月月1ppt课件免疫标记技术免疫标记技术1.定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.分类：放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP2ppt课件3ppt课件免疫酶测定法免疫酶测定法4ppt课件酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简
2、称ELISA，它是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原。ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。5ppt课件(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。(2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；(3).酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有
3、免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进行定性或定量分析。2、ELISA基本原理6ppt课件3、ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化；抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定；酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。7ppt课件 ELISA的试剂ELISA中有中有3 3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（聚苯乙烯板：具有较强的吸附
4、蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性）（2）酶标记的抗原或抗体（标记物）；（3）酶作用的底物（显色剂）；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）样品及标准本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液8ppt课件 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要类型有 双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。4、ELISA类别9ppt课件双抗体夹心法10ppt课件间接法11ppt课件以双抗体夹心法ELISA为例）：用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温
5、育加入底物，显色清洗清洗清洗终止反应，底物显色深浅与待检抗原量成正比。利用已知浓度的抗原制成标准品，稀释为梯度浓度，对其最终OD值与浓度作标准曲线，那么样品的浓度可以根据最终的OD值在标准曲线上查出。12ppt课件实验内容：实验内容：双抗体夹心法测定乙肝表面抗原（HBsAg）定性定量检测13ppt课件 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应用实验目的实验目的14ppt课件实验材料实验材料HBsAgHBsAg酶联免疫分析试剂盒酶联免疫分析试剂盒HBsAgHBsAg阳性品，阴性对照品阳性品，阴性对照品移液枪，枪头移液枪，枪头湿盒湿盒酶标板，酶标仪酶标板
6、，酶标仪一次性手套一次性手套记号笔记号笔计时器计时器15ppt课件实验步骤实验步骤16ppt课件结果判定结果判定定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性，N为阴性对照孔。定量测定：酶标仪测定450nm波长下的OD值，根据标准曲线计算样品抗原的浓度。17ppt课件 阳性：显色为黄色 阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阴性阴性 阳性阳性阳性阳性18ppt课件ELISAELISA注意事项注意事项 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。洗涤必须彻底，防止产生假阳性；温育常采用的温度有43、37、室温和4等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。温浴的时间要严格控制。19ppt课件课后问题 1、2、20ppt课件
