1、 激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术 Laser scanning confocal microscopy 1激光扫描共焦显微镜的设计特点激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 3.具有扫描系统 逐点扫描成像 4.激光作为光源 5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物 2Fluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcul
2、arExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal Microscope3人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm4 电子显微镜的缺点电子显微镜的缺点：1.由于样品需要固定由于样品需要固定,观测活细胞十分困难观测活细胞十分困难.2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 荧光显微镜的缺点荧光显微镜的缺点:1.无法实现对荧光无法实现对
3、荧光,透射光的同时采集透射光的同时采集,无法实现多荧光的无法实现多荧光的同时采集同时采集2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。4.无法对样品进行断层扫描无法对样品进行断层扫描,完成完成3D的工作的工作.5.对于信号较弱的样本对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度无法提高观察的灵敏度.6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠5激光共聚焦显微镜的应用激光共聚焦显微镜的应用 单、双、三单、双、三,四色标记检测。四色
4、标记检测。精确的一、二、三、四维观察。精确的一、二、三、四维观察。高品质的荧光成像、透射成像、物体表面高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。反射成像。静态和动态观察静态和动态观察(CACA2+2+,pH,pH,膜电位膜电位,膜流动膜流动性等性等)。定性以及定量分析。定性以及定量分析。光谱扫描光谱扫描,ROIROI扫描扫描.特殊的光反应特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGEDFREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等等)。6时间分辨和快速扫描动态图像出色的反射光图像明场，DIC,相差和透射光图像 单标，双标和三标图像 激光共聚焦显微成像技术的应用激光共聚焦显微成
5、像技术的应用7 一一.定位、定量定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量标）的定位、定量 如：细胞膜受体或抗原的分布，如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的两种或三种蛋白的共存共存与与 共定位共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化细胞凋亡细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI 末端原位杂交末端原位杂交-fitc+PI荧光原位杂交：荧光原位杂交：染色体基因定位染色体基因定位单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳GFP的表达的表达活细胞或活体组织静息游离活细胞或活体组织静息游离C
6、a2+的分布与定量的分布与定量活细胞内活细胞内pH的定量、膜电位的测量的定量、膜电位的测量活细胞内自由基水平的定量活细胞内自由基水平的定量 8Helagreen-中心体中心体red-纺锤体纺锤体 Immuno-fluorecence label9 二二.光学切片和三维重组光学切片和三维重组 光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。10显微显微CT与三维重组与三维重组11 3D reconstruction12 三三
7、.动态测量动态测量游离游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量测量pH值的检测值的检测 自由基的检测自由基的检测13相对相对 测量测量程序化测量程序化测量：用：用timelapse中的中的编程编程按钮按钮可可进行不同时间进行不同时间序列序列的扫描的扫描测量测量 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Physiology Chart(Time:11:40:49)0.0040.0080.00120.00160.00Int.200.00400.00600.00800.001000.001200.00sChannel 1Channel 20.0020.0040.0060.0080.00In
8、t.200.00400.00600.00800.001000.001200.00s14四四.细胞膜电位的测量细胞膜电位的测量标记膜电位探针标记膜电位探针(慢反应）：慢反应）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)484nm 500nm快反应探针：快反应探针：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nm 713nm细胞膜静息膜电位：细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电位：线粒体膜电位：-150mV以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体
9、膜电位探针 15FRAP(Fluorescence recovery after FRAP(Fluorescence recovery after photobleachingphotobleaching)原理原理Intense laser BeamBleaches FluorescenceRecovery of fluorescence10 seconds30 secondsZero timeTime%F五五.荧光漂白恢复荧光漂白恢复(FRAP:Fluorescence Recover after photobleaching）16荧光光漂白后的回复：荧光光漂白后的回复：FRAPFRAP 生
10、物膜脂质分子的侧向扩散；生物膜脂质分子的侧向扩散；胞间通讯的研究；胞间通讯的研究；胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等 细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。17六荧光能量共振转移六荧光能量共振转移(fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。量供体，能量
11、的接受者叫能量受体。荧光能量共振转移的条件荧光能量共振转移的条件两个荧光分子：供体两个荧光分子：供体-FL1，受体受体-FL2供体与受体的距离在供体与受体的距离在2-7nm供体供体的的发射波长发射波长与与受体受体的的激发波长激发波长一致一致18荧光共振能量转移（FRET）技术 生物大分子结构和功能研究 免疫分析 核酸杂交分析 蛋白质间相互作用研究r:分子间距离分子间距离 R0:分子间分子间发生发生50%能量转移的距离能量转移的距离 DAr 2R0Dr 2R0A19l检测检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的
12、荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。l应用：检测大分子的相互作用应用：检测大分子的相互作用 大分子构象的改变(蛋白)例：大分子(亚基)的结合与分离 受体与配体的结合 常用荧光探剂：常用荧光探剂：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP 20曲霉营养菌丝横隔不同霉菌自发荧光成像，示普通光学显微镜下不曾观察到的现象微生物自发荧光微生物自发荧光ConfocalConfocal成像成像21植物学应用植物学应用:植物细胞中的微管列阵植物细胞中的微管列阵(microtubule array)周质微管早前期微管带纺锤体成膜体22农业的应用农业的应用:植物细胞中的微丝分布植物细胞中的微丝分布
13、烟草悬浮培养细胞中的微丝网络烟草悬浮培养细胞中的微丝网络23农业的应用农业的应用:花粉萌发过程中微丝骨架的变化花粉萌发过程中微丝骨架的变化24农业的应用农业的应用:Jasplakinolide解聚微丝的实时观察解聚微丝的实时观察25Zaslavskaia et.al,Martek Biosciences,MD,June 15,200126November 2001;Volume 128(21):pp 4301-4314.Courtesy:Jose-Eduardo Gomes,University of Oregon,USANature,25 April 2002,pg 8542728 GFP-
14、MAP4融合蛋白表达显示微管融合蛋白表达显示微管骨架（美国骨架（美国Cyr实验室）实验室）29奶山羊发育中乳腺上皮细胞主要细胞器的变化 为研究奶山羊乳腺的胚后形态发育，采用活细胞荧光标记法结合激光共聚焦显微技术，观察奶山羊乳腺发育中主要细胞器的变化。根据奶山羊乳腺发育特点，采样时点分为：妊娠期 1 月、3 月、5 月；泌乳期 10 日、30、60 日、120 日；退化期 3 日、7 日、21 日，共计 10 个时点。30主要试剂及耗材主要试剂及耗材 DMSO 购自 Sigma 公司；优质胎牛血清（FBS）、DF12 培养基、I型胶原酶均购自 Gibco公司；内质网荧光探针（E-34251，激发
15、/发射波长为 504/511nm）、线粒体荧光探针（M-7512，激发/发射波长为 579/599nm）、Hochest 33258 均购自 Invitrogen公司。Confocal 专用细胞培养皿购自北京博蕾德科技公司。奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养 无菌切取 13g 乳腺组织，胶原酶消化法进行乳腺上皮细胞的分离培养。对胶原酶浓度及消化时间进行优化，确定最适酶浓度为 400U/ml，消化时间为 3.5 小时。以 1x106个/ml的密度铺于 Confocal 专用细胞培养皿中，置于 5CO2、37恒温培养箱中培养，并观察细胞生长情况。23 天更换培养液，观察细胞生
16、长约 8090汇合度时，进行细胞器荧光检测。31乳腺上皮细胞主要细胞器的检测乳腺上皮细胞主要细胞器的检测 37预热、终浓度为50nmol/L的M-7512工作液，37染色40min；37预热、终浓度为 1mol/L 的 E-34251 工作液，37染色 30min10g/ml 的 Hochest 33258 复染 5min图像采集与数据处理图像采集与数据处理 激光扫描共聚焦显微镜使用三通道（PMT）检测。激发谱线：405nm（激发 Hochest 33258 标记的蓝色荧光，染核 488nm（激发 E-34251 标记的绿色荧光，染内质网）543 nm（激发 M-7512 标记的红色荧光，染线粒体）。扫描模式为 xyz，以0.4m 的 Z 轴步距逐层扫描，点平均 2 次，面平均 4 次，三个通道序列扫描成像，overlay 处理后采图保存。32
