1、1APC、MGMT 分子變異與國人大腸癌發生及預後之關係 演演 講講 者：陳者：陳 錫錫 秉秉2研究背景簡介研究背景簡介3國人大腸癌發生率逐年攀升趨勢國人大腸癌發生率逐年攀升趨勢(Colorectal cancer,CRC)大腸癌：84 年國人發生率第 5 名的癌症85 年起升為第 4 名91 年起再攀升為第 3 名92 年起成為女性癌症的第 2 名93 年起成為男性癌症的第 2 名 新發生個案數從民國 84 年的 4217 人 增加到 94 年的 9604 人，(中華民國癌症登記報告)4大腸癌在所有癌症中排名大腸癌在所有癌症中排名 發生率排名 死亡率排名 男 女 男 女國人 2 2 3 3
2、美國 3 3 3 3 (中華民國 94 癌症登記報告,Siegel R et al.CA Cancer J Clin 2008)5國人大腸癌發生率成長曲線國人大腸癌發生率成長曲線 (中華民國行政院衛生署公佈資料)6國人國人94年大腸結直腸癌發生與死亡資料年大腸結直腸癌發生與死亡資料 新發生 粗發生率 新死亡 粗死亡率 個案數 (每10萬人)個案數 (每10萬人)全民 9604 42.18 4111 18.05男性 5497 47.54 2425 20.97 女性 4107 36.64 1686 15.04 (中華民國 94 癌症登記報告)7散發性(sporadic)：約90%年老、男性、體重過
3、重、高油低纖飲食、煙、酒、膽囊切除術、膽管腸道造廔術、女性動情激素、有腸道息肉病史、有結腸直腸癌病史、家族中有人罹大腸癌(不符合遺傳定律)危險因子危險因子(Weitz J et al.Lancet 2005)8遺傳性(hereditary)：約10%FAP:12%HNPCC:510%其它:1%Familial adenomatous polyposis(FAP)家族性腺瘤息肉症Hereditary nonpolyposis colorectalcancers(HNPCC)遺傳非息肉性大腸癌(Weitz J et al.Lancet 2005)9FAPAPC基因突變HNPCCMMR基因突變Ade
4、nomatous polyposis coli(APC)gene大腸腺瘤息肉基因Mismatch repair(MMR)genes修復DNA配對錯誤的基因危險因子危險因子(Weitz J et al.Lancet 2005)10約6080%具有APC 突變 FAPAPC突變表現度(penetrance)幾乎達100%HNPCCMMR突變表現度約7085%(Fearnhead NS et al.Hum Mol Genet 2001)遺傳性 散發性 後天產生的突變somatic mutation 與生俱來的突變germline mutation11APC 在大腸癌發展過程所處地位正常上皮早期腺瘤中
5、期腺瘤晚期腺瘤癌 Kras Smad1,Smad2APC p53 約約15年年12APC 基因簡介位置：染色體 5q21-5q22基因長度：91067 個鹼基對蛋白質產物：2843 個胺基酸,312 kD(NCBI OMIM*611731 APC GENE)13國外 germline APC 突變情形(Fearnhead NS et al.Hum Mol Genet 2001)14國外 somatic APC 突變情形(Fearnhead NS et al.Hum Mol Genet 2001)15研究目標研究目標一、研究國人 germline APC 基因變異與罹患大腸癌之關係。二、研究國人
6、大腸癌病人 somatic APC 基因變異與大腸癌用藥、預後存活之關係。16一、研究國人一、研究國人 germline APC 基因變異基因變異與罹患大腸癌之關係。與罹患大腸癌之關係。17研究設計研究設計疾病組跟對照組做比較研究，研究 APC 基因上的變異點在兩組人中分布差異。18研究對象研究對象收案條件疾病組：經慈濟及三軍總醫院大腸直腸科醫師確定 診斷為大腸癌患者。對照組：經大腸鏡檢查無發現大腸腫瘤者。本研究最後共收受健康受檢者 74 人，大腸癌病人 80 人，從周邊靜脈抽取其全血做為研究檢體。並無特別排除者。19臨床特質對照組74人疾病組80人年紀(平均值 標準差)54.3 10.161
7、.5 12.0性別(男性數目/百分比)34/45.3%40/50%Dukes分期(數目/百分比)A 8/10%B24/30%C38/47.5%D10/12.5%腫瘤位置(數目/百分比)近端近端16/20%遠端遠端26/32.5%直腸直腸38/47.5%研究對象基本特質研究對象基本特質http:/www.colorectal- 2.進行 PCR(polymerase chain reaction)放大 APC 全基因 exons 3.進行 dHPLC(denaturing high performance liquid chromatography)篩檢4.以 ABI Prism 3100 Ge
8、netic Analyzer 進行定序5.定序資料使用PC作業系統 BioEdit v7.0.5(Tom Hall,2005)軟體比對6.統計資料分析21ABI 3100定序結果範例22Bioedit 比對情形範例23結果結果24所有發現的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型基因變異胺基酸變異變異類型c.1050TG不改變SNP未報告過未報告過c.4479GA不改變SNPrs41115c.1378delGp.E460fs缺失未報告過未報告過c.4725AG不改變SNP未報告過未報告過c.1458TC不改變SNPrs2229992c.5034GA不改變SNPrs42427c.1488AT不改變S
9、NPrs9282599c.5268TG不改變SNPrs866006c.1635GA不改變SNPrs351771c.5465ATp.D1822VSNPrs459552c.3374TCp.V1125A突變未報告過未報告過c.5880GA不改變SNPrs465899c.3378CGp.S1126R突變未報告過未報告過fs:frameshift,轉譯框架移位25甘胺酸GlycineG天冬醯胺酸AsparagineN丙胺酸AlanineA麩胺酸Glutamic acidE纈胺酸ValineV麩醯胺酸GlutamineQ白胺酸LeucineL離胺酸LysineK異白胺酸IsoleucineI精胺酸Argi
10、nineR苯丙胺酸Phenylalanine F絲胺酸SerineS酪胺酸TyrosineY穌胺酸ThreonineT色胺酸TryptophanW甲硫胺酸MethionineM組胺酸HistidineH胱胺酸CysteineC天冬胺酸Aspartic acidD脯胺酸ProlineP26與國外 germline APC 變異比較圖(Fearnhead NS et al.Hum Mol Genet 2001)27兩組分佈有差異的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型對照組疾病組pc.1458TC不改變SNPrs2229992TT=2 CC=41CT=31TT=5 CC=62CT=13 0.0012
11、c.4479GA不改變SNPrs41115GG=2 AA=49 AG=23 GG=0 AA=69AG=11 0.0057c.5268TG不改變SNPrs866006TT=7 GG=44GT=23 TT=0 GG=63GT=17 0.0023c.5465ATp.D1822VSNPrs459552AA=64 TT=0AT=10 AA=78 TT=0AT=2 0.014528 基因變異 OR(95%CI)p c.1458TC C(vs.T)1.78(0.993.19)0.054 c.4479GA A(vs.G)2.89(1.376.07)0.005 c.5268TG G(vs.T)2.70(1.44
12、5.06)0.002 c.5465AT T(vs.A)0.18(0.040.81)0.026 基因變異對罹大腸癌之危險對比值(OR)29 變異點基因型 OR(95%CI)p c.1458TC CC 2.77(1.385.56)0.004 (vs.CT+CC)c.4479GA AA 3.20(1.447.11)0.004 (vs.AG+GG)c.5268TG GG 2.53(1.245.13)0.010 (vs.GT+GG)c.5465AT AT 0.16(0.030.78)0.023 (vs.AA)不同基因型對罹大腸癌之危險對比值(OR)30在健康人與病人組之間分佈有顯著差異的變異點有c.14
13、58TC、c.4479GA、c.5268TG、c.5465AT四點 c.1458TC、c.4479GA、c.5268TG 較高罹癌危險c.5465AT 較低罹癌危險結 果 摘 要31Germline APC 基因的突變率在國人大腸癌患者中極低，有可能是因為沒鎖定是 FAP的患者，也可能是國人發生大腸癌的重要觸發基因是別的基因。從國人 germline APC 基因的突變率低與在這麼少的突變之中就發現5處國外未報告過的變異，可合理推論測人罹大腸癌的基因相關性：有國人特有的種族特異性。找出國人大腸癌特異基因值得進一步的研究。討 論32二、研究國人大腸癌病人二、研究國人大腸癌病人 somatic A
14、PC 基基因變異與大腸癌用藥、預後存活之關係。因變異與大腸癌用藥、預後存活之關係。33研究設計研究設計取 CRC 病人大腸腫瘤組織，研究 APC 基因體突變(somatic mutation)對病人預後存活的關係，並取病人大腸正常組織做為 APC 基因變異之控制。34研究對象研究對象收案條件經慈濟與三軍總醫院大腸直腸科醫師確定診斷為大腸癌患者，並經外科切除手術可取得大腸組織(正常與癌組織)者。本研究共收受117位病人，紀錄其診出大腸癌年紀、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、癌症分期、化療及放療情形。35招募時間從 2001 年 1 月 1 日至 2004 年 12 月 31 日，追蹤觀察時間從受檢
15、者接受外科切除手術開始，追蹤觀察至其死亡或 2006 年 7 月 31 日截止。研究對象之存活時間以 Kaplan-Meier 法處理與分析。失去聯絡者或至觀察截止日期 2006 年 7 月 31 日仍存活者視為 censored observations，以 censored data 處理。36研究對象基本特質研究對象基本特質臨床特質病人117人年紀(平均值 標準差)65.5 14.2性別(男性數目/百分比)65/55.6%Dukes分期(數目/百分比)A9/7.7%B49/41.9%C34/29.0%D25/21.4%腫瘤位置(數目/百分比)近端21/21.2%遠端29/29.3%直腸4
16、9/49.5%37研究對象基本特質研究對象基本特質臨床特質病人117人 分化程度(數目/百分比)良好8/7.4%中度85/78.7%不良15/13.9%存活追縱月數(中位數/全距)24.37/0.33 64.53 5-FU化療(數目/百分比)61/52.1%放射線治療(數目/百分比)25/21.4%38結果39所有發現的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.634ATp.K212Xc.3374TCp.V1125Ac.904CTp.R302Xc.3493ATp.K1165Xc.1114AGp.N372Dc.3888delA p.A1296fsc.1452_1453insAAp.M48
17、5fsc.3899delAp.N1300fsc.1495CTp.R499Xc.3907CTp.Q1303Xc.2016_2017delTAp.H672fsc.3911_3915delTAGCAp.I1304fsc.2077ATp.K693Xc.3922ATp.K1308Xc.2804_2805insA p.Y935Xc.3925GTp.E1309Xc.2805_2806insTp.N936Xc.3926_3930delAAAGAp.E1309fsfs:閱讀框架移位 X:轉譯終止42240所有發現的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.3931_3932insAp.I1311fsc.
18、4260delCp.P1420fsc.3937delAp.T1313fsc.4348CTp.R1450Xc.3951delAp.E1317fsc.4358delCp.P1453fsc.3964GTp.E1322Xc.4463TGp.L1488Xc.4037CAp.S1346Xc.4667_46688insCp.T1556fsc.4055TCp.V1352Ac.6367TCp.C2123Rc.4057GTp.E1353Xc.8128ACp.S2710Rc.4067CGp.S1356Xc.8332GTp.A2778Sc.4169_4170delTCp.V1390fs241與國外 somatic A
19、PC 變異比較圖(Fearnhead NS et al.Hum Mol Genet 2001)MCR:mutation cluster region42APC突變與病人存活關係(Kaplan-Meier,全死因)時間(月數)有突變 非死亡截止點無突變 非死亡截止點0 10 20 30 40 50 60 70 100 90 80 70 60 50存活率(%)log rank testP=0.612 430 10 20 30 40 50 60 70 100 90 80 70 60時間(月數)存活率(%)APC突變與病人存活關係(Kaplan-Meier,大腸癌死因)log rank testP=0
20、.502 有突變 非死亡截止點無突變 非死亡截止點44 Coxs proportional-hazards model各因子致死的危險度使用 Coxs proportional-hazards model 分析。Hazard：存活者中下一瞬間死亡人數 上一瞬間存活人數即存活者下一瞬間死亡機率(死亡趨勢)45APC突變：有突變=1,無突變=0 H(t)/H0(t)=exp(1*APC突變)exp(1*1)=exp(1)=Hazard Ratio exp(1*0)=exp(0)=1exp(1)=2：任何時候有APC突變者的死亡趨勢 是無APC突變者的2倍迴歸模式可如下表示：H(t)=H0(t)*e
21、xp(1*基因突變+2*性別+)H(t)/H0(t)=exp(1*基因突變+2*性別+)=Hazard Ratio46單因子 Coxs proportional-hazards model 分析全死因CRC 死因Hazard Ratio(95%CI)pHazard Ratio(95%CI)p男性1.389(0.674 2.8642)0.3731.420(0.644 3.130)0.385年紀1.028(0.999 1.057)0.0611.015(0.986 1.045)0.318腫瘤位置遠端 直腸0.618(0.251 1.520)1.710(0.807 3.624)0.2940.1610.
22、585(0.219 1.560)1.575(0.707 3.509)0.2840.266癌症分期2.654(1.718 4.098)0.0013.053(1.866 4.995)0.001APC突變1.222(0.562 2.656)0.6121.330(0.578 3.060)0.503化療0.715(0.351 1.458)0.3560.994(0.458 2.157)0.987放療1.027(0.442 2.388)0.9501.036(0.415 2.583)0.94047多因子 Coxs proportional-hazards model 分析全死因CRC 死因Hazard Rat
23、io(95%CI)pHazard Ratio(95%CI)p癌症分期2.911(1.891 4.482)0.0013.053(1.866 4.995)0.001APC突變1.202(0.550 2.623)0.6451.330(0.578 3.060)0.483化療0.450(0.217 0.933)0.0320.994(0.458 2.157)0.22748APC突變與5-FU化療交互作用全死因CRC 死因Hazard Ratio(95%CI)pHazard Ratio(95%CI)p癌症分期2.993(1.946 4.604)0.0013.369(2.062 5.507)0.001化療0.
24、268(0.109 0.656)0.0040.339(0.130 0.886)0.027APC突變0.513(0.146 1.801)0.2970.443(0.096 2.043)0.297APC突變+化療5.565(1.061 29.190)0.0426.920(1.061 45.132)0.04349以APC有無突變分層分析全死因CRC 死因有APC突變者(29人)Hazard Ratio(95%CI)pHazard Ratio(95%CI)p癌症分期2.196(1.039 4.644)0.0402.615(1.144 5.974)0.023化療1.502(0.364 6.196)0.57
25、32.347(0.463 11.898)0.303無APC突變者(88人)癌症分期3.253(1.919 5.512)0.0013.648(1.978 6.728)0.001化療0.257(0.105 0.627)0.0030.342(0.131-0.891)0.02850117位病人中在29人中發現29處嚴重(造成閱讀框架移位或轉譯終止)突變 這些突變對病人預後存活無直接顯著相關這些突變與5-FU化療對於病人預後存活有交互作用5-FU化療只降低無這些突變的病人的死亡趨勢結 果 摘 要51討 論52Somatic APC 突變與 5-FU 化療的交互作用，這是首次發現並且會直接影響到病人臨床治
26、療效果的重大發現。此研究是小樣本的探索性研究，尚未控制很多重要的影響因子，但這個顯異的結果值得進一步招募更多參與者來做研究。參考此次初步研究結果，在往後的研究中，在招募參與者時，可先控制癌症分期、腫瘤位置、大腸癌類型等變項，若參與者夠多，可再控制年紀與性別變項。53此研究所發現的 APC 突變與 5-FU 化療的交互作用，其分子機制還不清楚，若能在眾多臨床研究上都確認此結果，則可做實驗室研究找出其分子機制。若能在眾多臨床研究上都確認此結果，應推廣到整個醫療體系上對於大腸癌患者的治療方針。我們建議對於考慮接受5-FU化療的大腸癌患者，宜先做APC基因檢測，無突變者再考慮是否進行5-FU化療。54
27、此次研究除了得到無 APC 基因突變者，接受 5-FU化療才有好效果的結論外，我們從研究結果應可合理懷疑有 APC 基因突變者，接受 5-FU 化療可能比不受 5-FU 化療結果更差，但因分層後樣本數變小，使上述結果不顯著，在往後研究中宜注意此點。55三、研究國人大腸癌病人三、研究國人大腸癌病人 somatic APC 與與 MGMT 基因基因 promoter 甲基化甲基化與大腸癌用藥、預後存活之關係。與大腸癌用藥、預後存活之關係。56甲基化甲基化(CH3)我們除了研究在 APC 基因本身的(genetic)變異之外，更考慮做基因外變異(epigenetic)中甲基化的研究。常發生在 pro
28、moter 區 CpG island 的 C 上ATGCTCGTAGTAGTCGCGTAA CH3 CH3 CH3 57O-6-Methylguanine DNA methyltransferase(MGMT)MGMT基因其它基因MGMT蛋白質甲基化去甲基化58MGMT基因其它基因MGMT蛋白質甲基化甲基化59APC 與 MGMT甲基化相關研究報告 APC 基因甲基化約在 12%到 39%。MGMT 基因甲基化約在40%到 50%。具有 K-ras 基因中鹼基 G 變 A 的變異者，MGMT 基因甲基化程度高。基因甲基化，該組織蛋白質表現度低。Lin SY et al.Oncol Rep.20
29、04 Chen J et al.Carcinogenesis.2005Arnold CN et al.Cancer Biol Ther.2004Esteller M et al.Cancer Res.2001 Qi J et al.World J Gastroenterol.2005Shen L et al.J Natl Cancer Inst.200560研究目標研究目標三、研究國人大腸癌病人 somatic APC 與 MGMT 基因 promoter 甲基化與大腸癌用藥、預後存活之關係。61研究方法研究方法1.全 DNA 經過 bisulfite 處理2.進行 MSP(methylati
30、on specific PCR)放大 APC 與 MGMT 基因 promoter 部份 DNA 片段3.進行電泳並以 ethidium bromide 染色並在 UV 光 下呈色判讀 M欄位有亮條：具有甲基化DNAU欄位有亮條：具有無甲基化DNA62結果結果本研究結果已發表之報告 APC 基因73/117人(62.4%)12%到 39%Lin SY et al.Oncol Rep.2004 Chen J et al.Carcinogenesis.2005Arnold CN et al.Cancer Biol Ther.2004 MGMT 基因 71/117人(60.7%)40%到 50%Es
31、teller M et al.Cancer Res.2001 Qi J et al.World J Gastroenterol.2005Shen L et al.J Natl Cancer Inst.200563APC甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,全死因)時間(月數)有甲基化 非死亡截止點無甲基化 非死亡截止點0 10 20 30 40 50 60 70 100 90 80 70 60 50存活率(%)log rank testP=0.018 640 10 20 30 40 50 60 70 100 90 80 70 60時間(月數)存活率(%)log rank testP=0.
32、076 有甲基化 非死亡截止點無甲基化 非死亡截止點APC甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,大腸癌死因)650 10 20 30 40 50 60 70 100 90 80 70 60時間(月數)存活率(%)log rank testP=0.982 有甲基化 非死亡截止點無甲基化 非死亡截止點MGMT甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,全死因)660 10 20 30 40 50 60 70 100 90 80 70 60時間(月數)存活率(%)log rank testP=0.992 有甲基化 非死亡截止點無甲基化 非死亡截止點MGMT甲基化存活曲線圖(Kaplan-Mei
33、er,大腸癌死因)67全死因CRC 死因Hazard Ratio(95%CI)pHazard Ratio(95%CI)p癌症分期2.837(1.837 4.382)0.0013.188(1.943 5.231)C、c.4479GA、c.5268TG有較高罹癌危險c.5465AT有較低罹癌危險。Somatic APC 基因無義或框架移位突變與5-FU化療對於病人預後存活有交互作用：5-FU化療只降低無這些突變的病人的死亡傾向。APC 甲基化降低病人全死因死亡趨勢。5-FU 化學治療只降低無 MGMT 基因甲基化病人死亡趨勢。總摘要總摘要72樣本不夠大，缺乏對一些相關變項的控制，研究結果之外推性不
34、佳，需進一步更大樣本更佳研究設計來驗證。未來可朝多醫療單位合作的研究，成立系統性聯合檢體收樣與保存中心，各種相關因素紀錄更加詳實，追蹤觀察時間可更長。更多其他癌症、基因與治療之間的交互作用，都是值得整個相關醫療合作與研究。研究限制與改進研究限制與改進73謝謝聆聽謝謝聆聽敬請指教敬請指教74中華民國行政院衛生署官方網站 http:/www.doh.gov.tw/cht2006/index_populace.aspx中華民國 94 癌症登記報告 2007年12月發佈Siegel R,Ward E,Hao Y,Xu J,Murray T,Thun MJ.Cancer statistics,2008.
35、CA Cancer J Clin.2008 Mar-Apr;58(2):71-96.Weitz J,Koch M,Debus J,et al.Colorectal cancer Lancet 2005;365:153-653.Fearnhead NS,Britton MP,Bodmer WF.The ABC of APC.Hum Mol Genet 2001;10:721-33.Narayan S,Roy D.Role of APC and DNA mismatch repair genes in the development of colorectal cancers.Mol Cancer
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