1、MiR-375MiR-375调控调控PDHK1PDHK1影响肝癌细胞能量代谢新机制影响肝癌细胞能量代谢新机制答辩人答辩人:许鑫森许鑫森 导师导师:刘昌刘昌7年制学生临床创新科研基金答辩年制学生临床创新科研基金答辩目录54321前期基础研究内容技术路线创新之处立项依据6年度研究计划1 1 立项依据立项依据-Warburg effect-Warburg effect肝癌细胞作为生长增殖失控的细胞，其重要的生物学标志是能量代谢异常。以糖酵解水平增强为主要表现（即“Warburg effectWarburg effect”）的糖代谢通路异常是其中的核心环节。正常细胞在有氧时通过糖的有氧氧化分解获取能量
2、，只有在缺氧时才进行无氧糖酵解；而肿瘤细胞无论在常氧还是在缺氧环境下，都表现为糖酵解水平显著增强，而线粒体内丙酮酸氧化效率受到抑制。Warburg效应的发现，将肿瘤特有代谢异常问题提到了重要地位。该现象目前被认为是肿瘤细胞恶性转化中的基础代谢改变，并被应用于肝癌的临床诊断和靶向治疗。丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）能够特异性抑制PDH活性，从而限制丙酮酸向乙酰辅酶A的代谢目前鉴定出4种PDHK同工酶：PDHK1、PDHK2、PDHK3以及PDHK4PDHK1能催化PDH全部三个磷酸化位点，因而对PDH的抑制作用更为关键调节糖酵解产生的丙酮酸转化成
3、乙酰辅酶A进入线粒体代谢丙酮酸脱氢酶激酶丙酮酸脱氢酶激酶（Pyruvate Dehydrogenase Kinase，PDHK）PDHK1在正常组织中被检测到微量表达，而在头颈部癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞中表达增强。1 1 立项依据立项依据-丙酮酸脱氢酶激酶异常表达丙酮酸脱氢酶激酶异常表达1 1 立项依据立项依据-肿瘤细胞中丙酮酸脱氢酶激酶的调控方式肿瘤细胞中丙酮酸脱氢酶激酶的调控方式Molecular Cell最近发表评论文章指出，最近发表评论文章指出，PDHK1在肿瘤细胞代谢在肿瘤细胞代谢重编程中发挥关键作用，具有重要的研究价值重编程中发挥关键作用，具有重要的研究价值。
4、microRNA作为影响基因转录后翻译的重要因子，被发现具有调控肿瘤细胞代谢的重要功能。1 1 立项依据立项依据-miRNA-miRNA与丙酮酸脱氢酶激酶与丙酮酸脱氢酶激酶然而microRNA是否具有靶向是否具有靶向PDHK1的作用尚未受到关注。的作用尚未受到关注。2 2 前期研究前期研究-基于芯片数据的线粒体相关基于芯片数据的线粒体相关miRNAsmiRNAs预测及筛选预测及筛选通过96对肝癌组织标本芯片筛选出5个与线粒体代谢功能相关且在肝癌中差异表达的候选miRNAsmiRNA名名称称基因定位基因定位肝癌中表达情肝癌中表达情况况（肝癌（肝癌/正常）正常）MNEGs中被中被证实靶基因数证实靶
5、基因数目目amiRNA与与MNEGs的相关的相关性性NCI-60肝癌标本miR-3752q350.1860.00010.0032miR-200b1p36.330.2020.00070.0001miR-188xp11.232.3410.00010.0156miR-18a13q31.32.6110.01680.0001miR-967q32.23.8920.00030.0382miRNA-375最早由Poy MN等于2004年在Nature杂志报道。随后的研究表明，miRNA-375与2型糖尿病以及胰岛素耐受相关，并能够影响胰岛细胞的发育和调控胰岛素的释放，参与全身糖代谢水平的调控。调控调控PDHK
6、1的潜在的潜在miRNAs 靶点基因靶点基因肿瘤类别肿瘤类别影响能量代谢影响能量代谢a相关文献相关文献miR-375JAK2胃癌未报道Ding L(2010)PDPK1胃癌食管癌与糖代谢相关Tsukamoto Y(2010)Li X(2011)YWHAZ胃癌未报道Tsukamoto Y(2010)RASD1乳腺癌未报道Souza(2010)YAP肝癌肺癌未报道Liu AM(2010)Nishikawa E(2011)Sec23A前列腺癌蛋白质转运相关Szczyrba J(2011)AEG-1头颈鳞状细胞癌肝癌未报道Nohata N(2011)He XX(2011)IGF-1食管鳞状细胞癌与糖代
7、谢相关Kong KL(2012)LDHB头颈鳞状细胞癌上颌窦鳞状细胞癌糖代谢关键酶编码基因Nohata N(2011)Kinoshita T(2012)不同肿瘤细胞miR-375靶点基因及与能量代谢通路的关系2 2 前期研究前期研究-miRNA-375-miRNA-375与肿瘤关系密切与肿瘤关系密切最近研究发现，miR-375还在肿瘤细胞中发挥重要作用。2 2 前期研究前期研究-运用多种预测软件对运用多种预测软件对miR-375miR-375靶点进行预测靶点进行预测经预测，miR-375能够结合到PDHK1的3UTR区域。同时，利用多个miRNA靶基因预测网站（miRanda，miRDB，mi
8、RWalk以及Targetscan）对分析结果进行验证，能够佐证miR-375靶基因的预测结果。通过miRanda软件共发现miR-375与PDHK1关系密切进一步对miR-375前体及miR-375成熟体的二级结构进行分析2 2 前期研究前期研究-运用多种预测软件对运用多种预测软件对miR-375miR-375靶点进行预测靶点进行预测利用热力学模型对miR-375与PDHK1的结合能量改变进行预测对7种肝癌细胞系进行miR-375表达检测（HepG2，Hep3B，HuH-7，SMMC-7721，MHCC-97H，MHCC-97L，SK-HEP-1）在肝癌组织标本中验证miR-375与上PDH
9、K1的表达相关性2 2 前期研究前期研究-miR-375-miR-375与与PDHK1PDHK1的表达相关性分析的表达相关性分析基于前期结果，本项目的研究思路为基于前期结果，本项目的研究思路为：3 3 研究内容研究内容本课题的开展能够深入探讨microRNA作为一种调控肝癌细胞代谢重编程的新机制，并为寻找新的肝癌靶向治疗策略提供有利条件。基于肝癌细胞模型，进一步明确miR-375能够作为新的机制参与负调控关键酶PDHK1通过调控miR-375表达水平进一步验证miR-375/PDHK1通路在肝癌细胞代谢重编程过程中的作用。探讨miR-375作为肝癌治疗新靶点的可能性。4 4 研究拟采取的技术路
10、线研究拟采取的技术路线4 4 研究拟采取的技术路线研究拟采取的技术路线5 本项目的创新之处本项目的创新之处在肝癌细胞水平上系统全面的探讨系统全面的探讨miR-375在在肿瘤细胞能量代谢中的作用及其分子机制肿瘤细胞能量代谢中的作用及其分子机制将生物信息学分析技术和分子生物学实验技术将生物信息学分析技术和分子生物学实验技术联合应用于特定联合应用于特定miRNA的筛选、靶基因预测和的筛选、靶基因预测和验证的研究策略验证的研究策略miRNA肿瘤代谢线粒体相关miRNA的生物信息分析策略5个候选miRNAs统计学分析以及靶基因预测手段miR-3756 6 年度研究计划年度研究计划及研究成果及研究成果 年
11、度研究计划：年度研究计划：2012.05-2012.12 完成不同代谢条件下多种肝癌细胞系miR-375表达水平的检 测；构建miR-375过表达的肝癌细胞模型，利用上述肝癌 细胞模型，检测不同miR-375表达水平对肝癌细胞线粒体 能量代谢的影响。2012.12-2013.04 利用双荧光报告基因以及miRNA表达调控实验验证miR-375与预测靶点PDHK1的调控关系。2013.04-2013.05 研究资料的汇总、整理等工作，论文发表。预期研究成果：预期研究成果：1）全面验证miR-375表达水平对肝癌细胞线粒体能量代谢的影响。2）系统阐明miR-375调控肝癌细胞线粒体能量代谢的分子机制。3）发表文章：国内外高水平期刊1-2篇。
