1、第四章灭菌及染菌的防治第四章灭菌及染菌的防治一、定义：一、定义：灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命有机体的过程。物料及设备中所有生命有机体的过程。二、工业灭菌分类二、工业灭菌分类 第一节第一节 概述概述.物理灭菌：高温、辐射、过滤灭菌物理灭菌：高温、辐射、过滤灭菌.化学物质灭菌：化学药剂化学物质灭菌：化学药剂.物理灭菌物理灭菌（1）干热灭菌：）干热灭菌：干热空气或火焰干热空气或火焰l 干热空气灭菌干热空气灭菌 生产上常用的灭菌条件为生产上常用的灭菌条件为160-170、1.5h以上。以上。l 火焰灭菌：火焰灭菌：主要用于金属接种工具
2、、试管口、锥形主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接种移液管和滴管外部灭菌。瓶口、接种移液管和滴管外部灭菌。l特点：时间长、耗热量大，应用不广。特点：时间长、耗热量大，应用不广。l应用：一般用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。应用：一般用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。（2）湿热灭菌蒸汽灭菌用高压蒸汽将物料升温到用高压蒸汽将物料升温到115140保持一定保持一定时间。常用的灭菌条件是时间。常用的灭菌条件是120，2030min。l优点：优点：微生物对干热的耐受比微生物对干热的耐受比湿热大得多湿热蒸汽有潜热湿热对微生物细胞具有强大的穿透力l应用：广泛用于物料或设备容器的灭菌。物料或设备容器的灭
3、菌。l热阻指标：杀灭芽孢杆菌的温度和时间热阻指标：杀灭芽孢杆菌的温度和时间常见热阻指标：常见热阻指标：115，30min 120，15min 130，30min（3）射线灭菌）射线灭菌l方法：方法：通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌。通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌。其中以紫外线最常用。其中以紫外线最常用。l原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸收光谱相一原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸收光谱相一致，致，DNA链上核苷酸的碱基因此具有强烈的吸收紫外线的链上核苷酸的碱基因此具有强烈的吸收紫外线的能力，引起能力，引起DNA结构形式的变化而导致死亡。结构形式的变化而导致死
4、亡。l特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力极低极低l应用：只能用于表面灭菌。主要用来进行一定空间内空气应用：只能用于表面灭菌。主要用来进行一定空间内空气的灭菌（如无菌室等）。的灭菌（如无菌室等）。（）介质过滤除菌（）介质过滤除菌定义：采用过滤介质，如滤膜，过滤器等过滤定义：采用过滤介质，如滤膜，过滤器等过滤原理：过滤介质的孔径一般很小，不能用于培养基或设备等原理：过滤介质的孔径一般很小，不能用于培养基或设备等的灭菌的灭菌应用：少数澄清的液体成分应用：少数澄清的液体成分发酵过程中所用的大量无菌空气发酵过程中所用的大量无菌空气.化学灭
5、菌化学灭菌l定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞接触定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞接触而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。目的。l化学灭菌的优点：化学灭菌的优点：（1）杀菌谱广，有效浓度低且杀灭微生物的速度快。）杀菌谱广，有效浓度低且杀灭微生物的速度快。（2）性质稳定，易溶于水且可在常温下使用。）性质稳定，易溶于水且可在常温下使用。（3）无腐蚀性，无毒或低毒，使用安全。）无腐蚀性，无毒或低毒，使用安全。（4）效率低，易残留，损耗大。）效率低，易残留，损耗大。l常用的化学药剂：常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新乙醇、甲
6、醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和苯酚、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。（石炭酸）等。l用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、器具用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、器具及无菌区域的灭菌，很少用于培养基的灭菌。及无菌区域的灭菌，很少用于培养基的灭菌。第二节第二节 培养基及有关设备的灭菌培养基及有关设备的灭菌 工业上对培养基及有关设备的灭菌多采用湿热机蒸工业上对培养基及有关设备的灭菌多采用湿热机蒸汽灭菌具体包括：汽灭菌具体包括：实罐灭菌（实消）实罐灭菌（实消）空罐灭菌（空消）空罐灭菌（空消）连续灭菌（连消）连续灭菌（连消）附属设备灭菌附属设备灭菌一、实罐灭菌（
7、分批灭菌）一、实罐灭菌（分批灭菌）分批灭菌是将配制好的培养基分批投入发分批灭菌是将配制好的培养基分批投入发酵罐中，经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸酵罐中，经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸汽使培养基和设备一起灭菌。汽使培养基和设备一起灭菌。流程：流程：培养基预热培养基预热 培养基灭菌培养基灭菌 冷却冷却过程：过程：1培养基预热：将各排汽阀打开，蒸汽由蛇管或夹套引入，培养基预热：将各排汽阀打开，蒸汽由蛇管或夹套引入，温度温度8090。目的：目的：防止培养基与蒸汽温差过大，产生冷凝水稀释培养防止培养基与蒸汽温差过大，产生冷凝水稀释培养基或泡沫急增。基或泡沫急增。2培养基灭菌：将蒸汽由培养基灭菌：
8、将蒸汽由进气口、进料口、取样口等进气口、进料口、取样口等导入罐内，导入罐内，120 130，保温，保温30min。目的：使罐内液体翻动剧烈，物料达到均一的灭菌温度。目的：使罐内液体翻动剧烈，物料达到均一的灭菌温度。3冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却目的：避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。目的：避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。进气口、进气口、进料口、进料口、取样口等取样口等进蒸汽进蒸汽 二、二、空罐灭菌（空消）空罐灭菌（空消）空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空
9、罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。由进汽阀引入蒸汽，空罐灭菌一般维持罐压由进汽阀引入蒸汽，空罐灭菌一般维持罐压1.51052.0105Pa，罐温，罐温125130，3045min。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却过灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。水冷却。三、三、连续灭菌（连续灭菌）连续灭菌（连续灭菌）培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌，培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。酵罐中。
10、流程：流程：培养基预热培养基预热 连续灭菌连续灭菌 维持灭菌温度维持灭菌温度 冷却冷却培养基预热培养基预热 连续灭菌连续灭菌 维持灭菌维持灭菌 冷却冷却过程：过程：1培养基预热：培养基预热：6075，避免连续灭菌时由于料液与蒸，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大。汽温度相差过大。2连续灭菌：连消塔中高温蒸汽连续灭菌，温度一般以连续灭菌：连消塔中高温蒸汽连续灭菌，温度一般以125135，时间，时间5min左右为宜。左右为宜。3维持灭菌温度：利用维持罐使料液在灭菌温度下保持维持灭菌温度：利用维持罐使料液在灭菌温度下保持57min，蒸汽，蒸汽100，4-5105Pa,以达到彻底灭菌的目的。以达
11、到彻底灭菌的目的。4冷却：采用冷水喷淋时，喷淋前冷却管内应充满填料。冷却：采用冷水喷淋时，喷淋前冷却管内应充满填料。特点：特点：（1）连续灭菌的时间短、温度较高。培养基受到）连续灭菌的时间短、温度较高。培养基受到的破坏较少，故质量较好。的破坏较少，故质量较好。（2）不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染）不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。菌的机会也相应增多。四、发酵附属设备及管路的灭菌发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。过程同空消等。过程同空消.工业生产中对空气质量的要求是工业生产中对空气质量的要求是：无菌
12、，无：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油等。灰尘，无杂质，无水，无油等。第三节第三节 空气过滤除菌空气过滤除菌粉尘颗粒粉尘颗粒微生物微生物.空气除菌方法空气除菌方法 辐射杀菌辐射杀菌静电除菌静电除菌湿热杀菌湿热杀菌化学药品法化学药品法过滤除菌法过滤除菌法.空气过滤除菌的机制空气过滤除菌的机制 包括：截留作用、沉降作用、静电吸附、包括：截留作用、沉降作用、静电吸附、惯性碰撞、扩散现象惯性碰撞、扩散现象 等等.空气过滤除菌特点：空气过滤除菌特点：（）空气流动性好；（）空气流动性好；（）微生物附着于尘粒上，过滤除尘粒的同时（）微生物附着于尘粒上，过滤除尘粒的同时除微生物。除微生物。二、空气过滤介质二、
13、空气过滤介质1、要求：能耐高温、高压，不、要求：能耐高温、高压，不易被油水污染。且成本低、易被油水污染。且成本低、易更换。易更换。2、常用的空气过滤介质：、常用的空气过滤介质：棉花棉花、活性炭、玻璃棉、超细玻璃活性炭、玻璃棉、超细玻璃纤维纸、石棉滤板等。纤维纸、石棉滤板等。3、新型过滤介质：膜过滤器。、新型过滤介质：膜过滤器。无菌空气无菌空气 空气空气高空取气管高空取气管除尘器除尘器空气压缩机空气压缩机贮气罐贮气罐一级冷却器一级冷却器油水分离器油水分离器二级冷却器二级冷却器除雾器除雾器加热器加热器过滤器过滤器具体过程具体过程1、空气的采集和压缩、空气的采集和压缩 采集：空气采集口一般设置距离地
14、面至少采集：空气采集口一般设置距离地面至少10-15m，远离尘埃集中位置，尽量设置于上风口方，远离尘埃集中位置，尽量设置于上风口方向；空气自采集口进入空气压缩机前先通过向；空气自采集口进入空气压缩机前先通过粗过粗过滤装置滤装置去除大的尘埃颗粒。去除大的尘埃颗粒。u空气采集口应尽量提高，每升高米，微生物少一个数量空气采集口应尽量提高，每升高米，微生物少一个数量级级、空气压缩：涡轮空压机和往复式空压机，使空、空气压缩：涡轮空压机和往复式空压机，使空气温度升高到气温度升高到120150、空气储罐：沉降大的水、油、空气储罐：沉降大的水、油、两次冷却，两次冷却，空气第一次冷却到空气第一次冷却到3035，
15、第二，第二级冷却至级冷却至2025，压缩空气冷却后相对湿度可，压缩空气冷却后相对湿度可达达100%,达露点，凝结为水滴、油滴达露点，凝结为水滴、油滴、旋风分离：除空气凝结的水、油、旋风分离：除空气凝结的水、油、丝网分离：除剩余凝结水油及蒸汽、丝网分离：除剩余凝结水油及蒸汽、总过滤器（高效、亚高效）充分过滤除菌。、总过滤器（高效、亚高效）充分过滤除菌。第四节 发酵染菌的原因及防治、种子带菌、种子带菌接种瓶中剩余的少量种子液继续进行培养，以观察判定接种瓶中剩余的少量种子液继续进行培养，以观察判定是否为种子带菌。是否为种子带菌。制备种子时对沙土管、冷冻管、斜面及摇瓶进行严格控制备种子时对沙土管、冷冻
16、管、斜面及摇瓶进行严格控制。制。一、常见的染菌原因及防治一、常见的染菌原因及防治、设备及附件渗漏最常见、设备及附件渗漏最常见1）化学腐蚀）化学腐蚀 原因：培养基成分复杂，或有酸、碱等与设备金属原因：培养基成分复杂，或有酸、碱等与设备金属发生化学作用发生化学作用措施：使用耐腐蚀材料、防腐涂料。措施：使用耐腐蚀材料、防腐涂料。）磨损）磨损 原因：培养基中的固体成分，与设备长期摩擦。原因：培养基中的固体成分，与设备长期摩擦。措施：培养基中固体成分充分研细，定期检查设备措施：培养基中固体成分充分研细，定期检查设备）电化学腐蚀）电化学腐蚀 还没有可以防止的方法。还没有可以防止的方法。、培养基灭菌不彻底、
17、培养基灭菌不彻底1）蒸汽压力不足或蒸汽量不足以及灭菌时间不够；）蒸汽压力不足或蒸汽量不足以及灭菌时间不够；2）灭菌时培养基产生大量泡沫或发酵罐内有污垢）灭菌时培养基产生大量泡沫或发酵罐内有污垢堆积以及培养基中有不溶解的固体颗粒；堆积以及培养基中有不溶解的固体颗粒；3）设备制作或安装不合理，存在着蒸汽不易到达）设备制作或安装不合理，存在着蒸汽不易到达的部位，造成的部位，造成“死角死角”。、空气系统、空气系统1）油掺入空气和列管式冷却器穿孔。）油掺入空气和列管式冷却器穿孔。可采用无润滑油活塞式空气压缩机和定期检查列管式冷却器可采用无润滑油活塞式空气压缩机和定期检查列管式冷却器来解决。来解决。2）空
18、气过滤器过滤介质松动、过滤介质老化、操作不当使过）空气过滤器过滤介质松动、过滤介质老化、操作不当使过滤介质受潮、灭菌时被冷凝水润湿等。滤介质受潮、灭菌时被冷凝水润湿等。可通过严格按操作规程操作，定期更换过滤介质和检修过滤可通过严格按操作规程操作，定期更换过滤介质和检修过滤器加以解决。器加以解决。五、噬菌体污染较少见，但后果最严重五、噬菌体污染较少见，但后果最严重噬菌体污染会出现的现象：噬菌体污染会出现的现象：发酵液突然转稀，泡沫增多，在较短时间内菌发酵液突然转稀，泡沫增多，在较短时间内菌体大量自溶，平皿培养出现典型的噬菌斑，培养液体大量自溶，平皿培养出现典型的噬菌斑，培养液变稀，泡沫上升。变稀，泡沫上升。处理方法：处理方法：（1）发酵液用高压蒸汽彻底灭菌放掉，严防发酵）发酵液用高压蒸汽彻底灭菌放掉，严防发酵液任意流失。液任意流失。（2）发酵罐、附属设备及周围环境彻底清理、检）发酵罐、附属设备及周围环境彻底清理、检查并灭菌。查并灭菌。（3）更换菌种乃至更换抗生素的生产品种，可防）更换菌种乃至更换抗生素的生产品种，可防止噬菌体的重复污染。止噬菌体的重复污染。二、染菌的判断及防治措施二、染菌的判断及防治措施、判断：）无菌实验、判断：）无菌实验）发酵参数检控）发酵参数检控）发酵液性状）发酵液性状、处理：）前期染菌、处理：）前期染菌）中期染菌）中期染菌）噬菌体污染）噬菌体污染
