1、实验三实验三细菌芽孢染色和革兰氏染色 实验目的实验目的a.复习细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤和关键点b.掌握革兰氏染色法、芽孢染色法的步骤和关键点c.学习无菌操作技术实验原理实验原理a.革兰氏染色实验原理b.芽孢染色实验原理 实验材料实验材料显微镜，擦镜纸，载玻片,插镜纸,接种环,镊子,酒精灯;革兰氏染液、孔雀绿染液；香柏油,自来水,95%酒精;苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）,大肠杆菌（Escherichia coli）,四联球菌（Micrococcus tetragenus）LB培养基革兰氏染色实验步骤n1.涂片n左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧,
2、冷却后从试管中去菌液一滴,在洁净载玻片上做一涂膜;n从固体斜面或平板上取菌时,用无菌接种环取适量菌体,涂抹均匀于玻片上预先滴有的一滴自来水中;n2.干燥n在空气中自然干燥或在火焰快速通过干燥(与热固定同步进行).n3.热固定n用镊子夹住涂片一端,在火焰上连续通过几次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜.n4.染色染色n初染在固定的标本上加结晶紫染液1-2滴,染色1min,轻轻滴加水洗;吸干,n媒染滴加1-2滴革氏碘液媒染1min,轻轻水洗,吸干。n脱色滴加95%乙醇溶液(或30%丙酮乙醇脱色),轻轻摇动玻片至液滴无色,不要过分脱色(约30秒),立即轻轻滴加水洗;吸干。n复染滴加蕃红染液复染2min
3、,轻轻滴加水洗;n镜检吸干载玻片背面及标本周围水渍，镜检;n5.镜检结果绘图并表明革兰氏染色结果n注意标本中细菌的形态,大小,排列,和颜色.n革兰氏阳性菌为紫色;n革兰氏阴性菌为红色;金黄色葡萄球菌(24hrs)染色结果金黄色葡萄球菌(48hrs)染色结果金黄色葡萄球菌(72hrs)染色结果芽孢染色法（Schaeffer与Fulton氏染色法）n（1 1）涂片）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。n（2 2）晾干固定：）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2 23 3次。次。n（3 3）染色：）染色：n加染色液：加加
4、染色液：加5%5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算度），然后将涂片用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持时间，约维持5min5min。加热过程中要随时添加染色液，。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。本干涸。（加热时温度不能太高）。n水洗：水洗：待玻片冷却后待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。染色液为止。n复染：用蕃红液染色复染：用蕃红液染色5min5min。n（4）水洗、晾干或吸干。n（
5、5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞、伴孢晶体和菌体的形态以及芽孢的着生位置。n结果：芽胞呈绿色，菌体和伴孢晶体为红色。2、伴孢晶体（、伴孢晶体（parasporal crystal）少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体蛋白晶体内毒素，称为伴孢晶体。内毒素，称为伴孢晶体。伴孢晶体对伴孢晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，因而可将这类产伴孢晶体的细菌制成有利于环境保护的生物农因而可将这类产伴孢晶体的细菌制成有利于环境保护的生物农药药细菌杀虫剂。细菌杀虫剂。特点：不溶于水，对蛋白酶类不敏感；容易溶于碱性溶剂。作业n记录并描绘革兰氏染色、芽孢染色结果,注意形状,排列和颜色,看看与理论上是否相同;如不同,分析原因;n分析影响革兰氏染色结果的因素;准备实验三放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察祝您成功！
