1、2022-12-29苯甲醇、苯甲酸、水杨酸的毛细管电泳分离苯甲醇、苯甲酸、水杨酸的毛细管电泳分离教师教师 肖艳玲肖艳玲0808级综合实验级综合实验 2010.102010.102022-12-29一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：1、掌握毛细管电泳的基本概念；2、通过实验熟悉毛细管电泳仪的基本原理和操作；3、了解影响毛细管电泳分离的主要操作参数。2022-12-29二、基本概念：二、基本概念：二、基本概念：二、基本概念：二、基本概念：二、基本概念：电泳：电泳：在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电
2、极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。高效毛细管电泳高效毛细管电泳:(CE,capillary electrophoresis)，以毛细管为分离通道（用75um内径石英毛细管），以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性为分离依据的分析技术。高效毛细管电泳。2022-12-29电渗流现象电渗流现象电渗流现象电渗流现象电渗流现象电渗流现象电渗流：电渗流：毛细管内壁表面电毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体荷所引起的管内液体的整体流动流动，来源于外加电场对管，来源于外加
3、电场对管壁溶液双电层的作用壁溶液双电层的作用 电渗现象中整体移动着的液电渗现象中整体移动着的液体叫体叫电渗流电渗流（electroosmotic flow，简称简称EOF）。）。电渗现象电渗现象:当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象叫电渗现象.2022-12-29HPCEHPCEHPCE中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向电渗流的大小电渗流的大小:用电渗流速度用电渗流速度电渗流电渗流表示，取决于电渗淌度表示，取决于电渗
4、淌度和电场强度和电场强度E E。即即 电渗流电渗流=E E淌度：淌度：取决于带电离子在单位电场下的迁移速度；取决于带电离子在单位电场下的迁移速度；是特征常数是特征常数 淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。2022-12-29电渗流的作用：电渗流的作用：电渗流的作用：电渗流的作用：电渗流的作用：电渗流的作用：电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍；（1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，）改变电渗流的大小和方向可改变分
5、离效率和选择性，如同改变如同改变LCLC中的流速；中的流速；在在HPCE中，控制电渗流非常重要中，控制电渗流非常重要。电渗流的方向电渗流的方向:取决于毛细管内表面电荷的性质：取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；2022-12-29分离过程分离过程分离过程分离过程分离过程分离过程 电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现电泳现象象和电渗流现象电渗流现象
6、。带电粒子的带电粒子的迁移速度迁移速度=电泳电泳+电渗流；电渗流；两种速度的矢量和两种速度的矢量和。正离子正离子：两种效应的运动方向一致，在两种效应的运动方向一致，在负极最先流出负极最先流出；中性粒子中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出在阳离子后流出；阴离子阴离子：两种效应的运动方向相反两种效应的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出。在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。（动画）动画）2022-12-29三、高效毛细管电泳三、高效毛细管电泳三、高效毛细管电泳(HPCE)HPCE)HPCE)基本原
7、理基本原理基本原理1.1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间）HPCEHPCE兼具有兼具有电化学的特性电化学的特性和和色谱分析色谱分析的特性。有关色谱的特性。有关色谱理论也适用。理论也适用。VLLELLtapefapefapef V外加电压；L毛细管总长度；2.2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数）在在HPCEHPCE中，仅存在纵向扩散，中，仅存在纵向扩散，2 2=2=2DtDt22/154.5;22 YtnDELDLVLnRefapefap 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。物大分子的依据。2022-12-2
8、93.3.3.分离度分离度分离度 DLVLRefap 平均平均 177.0 影响分离度的主要因素；工作电压影响分离度的主要因素；工作电压V V；毛细管有效长度毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：221apap 平均平均1212)(2WWttR2022-12-29高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：
9、电压升高，电场推动力大；柱径小，柱长增加。高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。一、采用了一、采用了 75um 内径的毛细管；内径的毛细管；二、采用了高达数千伏的电压。二、采用了高达数千伏的电压。2022-12-29高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点1.1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种
10、阳离子；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；4.4.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；2022-12-29四、仪器结构及主要部件四、仪器结构及主要部件四、仪器结构及主要部件四、仪器结构及主要部件四、仪器结构及主要部件四、仪器结构及主要部件紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-1910-21 mol/L）1.高压电源高压电源2.毛细管柱毛细管柱3.缓冲液池缓冲液池4.检测器检测器2022-12-291.1.1.1.1.1.高压电源高压电源高压电源高压电源高压电源高压电源（1
11、 1）0 03030 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；2.2.毛细管柱毛细管柱（1 1）材料：石英（）材料：石英（分离柱不涂敷任何固定液）各项各项性能好；性能好；（2 2）规格：）规格：内径内径 2075m，外径外径350400m；长度长度1m2022-12-293.3.3.3.3.3.缓冲液池缓冲液池缓冲液池缓冲液池缓冲液池缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好；4.4.检测器检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数
12、据处理一体化；类型类型 检测限检测限/mol 特点特点紫外 10-1310-15 光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生2022-12-291.离子分析离子分析analysis of ion2.药物分析药物分析analysis of pharmaceutics3.氨基酸分析氨基酸分析analysis of amino acids4.核酸分析及核酸分析及DNA测序测序analysis of nucleic acids and sequence of DNA5.新进展及热点问题新进展及热点问题advances and sp
13、ecial topics高效毛细管电泳应用与进展高效毛细管电泳应用与进展高效毛细管电泳应用与进展2022-12-291.1.1.离子分析离子分析离子分析2022-12-292.2.2.药物分析药物分析药物分析 检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；2022-12-293.3.3.氨基酸与蛋白质分析氨基酸与蛋白质分析氨基酸与蛋白质分析可分离23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；蛋白质分析2022-12-294.4.4.核酸分析及核酸分析及核酸分析及DNADNADN
14、A排序排序排序2022-12-29五、操作步骤五、操作步骤五、操作步骤五、操作步骤五、操作步骤五、操作步骤1.打开计算机和主机，预热 30min。2.双击 32Karat 7.0工作界面，选择进入 UV 检测项。3.切换至工具栏里的 Direct Control 选项，按下 Load，并将样品按照匹配程序的位置放置。（注意：毛细管对准样品管口 向瓶中装样时，样品不应过满，也不能沾湿瓶颈。）4.在工具栏里选择 Time Program 选项，对以下将要进行的步骤进行编写。2022-12-295.按下工具栏里的蓝色箭头（Single Run），运行仪器。注意：运行时不能打开盖子注意：运行时不能打开
15、盖子6.依次检测标样标样和未知样未知样，并在工具栏里的 Reports 里的View(Area%)查看实验结果。7.结束测量时，用缓冲液清洗 1015min，按下Home键。8.关闭主机和计算机电源。2022-12-29NOTime(min)EventValueDurationLnlet(vial)Outlet(vial)Sum mary1Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B1B0:B1forward2Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B2B0:B1forward3Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B3B0:B1forward4Lnject-Pressure0.5psi5.0secSl:A1B0:A1Override,forward50:00Separate-Voltage25.0KV8minBl:A1B0:A10.17min ramp,nomal polanty610:00Stop data-710:01Rinse-Pressure20.0psi2.0minBl:A1B0:B1forward812:01End-9附：操作程序附：操作程序
