1、液相色谱柱的选择和方法开发 奥秘科技/AUMI Technologies（US）内容概要内容概要?色谱基本概念回顾?色谱柱类型、选择和方法开发 色谱基本概念回顾色谱基本概念回顾 色谱（chromatography）?色谱原理?色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相?色谱功能：分析（种类/定量），纯化?液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）分离度)1()1()4(?kkaaNRs?Rs-Resolution?N Theoretical Plate Number?Selectivity?k Ret
2、ention Factor?拖尾 1.Separation of Compounds A and B 灵敏度?：Limit of Detection?：Limit of Quantification 柱效 峰形（拖尾因子）重现性?分离度（）保留时间（，）选择性（）柱效（）?灵敏度 色谱柱类型、选择和方法开发色谱柱类型、选择和方法开发 色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响?分离度 -选择性 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 -柱效 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相，温度，上样量，流速?峰对称性 基质表面特性，键合类型，流动相，温度?保留体积 柱长，孔隙率
3、，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度?灵敏度 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度?稳定性和重现性 基质表面特性，键合类型；流动相，温度 流动相 pH，缓冲盐种类，溶剂；影响色谱柱性能的主要因素 1、色谱柱的构型?色谱柱内径?色谱柱长度 2、固定相柱填料?粒径?比表面积?孔径?孔隙率?基质表面特性：-表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 -耐碱性?键合类型 -官能团、是否封尾 -键合相的保留行为、耐酸性 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响色谱柱的构型对色谱柱性能的影响 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径 色谱柱尺寸 对色
4、谱分离的影响：?短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低?长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长?窄径柱(?2.1mm)满足检测器和样品量限制?宽径柱(3-7.8 mm)-载样量高，抗污染，寿命 制备柱(内径 10 mm)用于纯化制备 柱填料对色谱柱性能的影响柱填料对色谱柱性能的影响 柱填料对柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径色谱柱性能的影响：粒径 硅胶粒径和类型对柱效的影响 d 硅胶粒径和类型对压力的影响 柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II 目前市场主要可供选择的填料粒径目前市场主要可供选择的填料粒径?1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪?2.7
5、m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)?3.0m，3.5m 普通快速分析?5.0m 常规分析 颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积?每克填料的表面积，与粒度，孔径有关?比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)?根据需要选择合适的比表面积 柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I?多孔材料的95%以上表面在孔内部?样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部?孔径至少是样品流体学直径的4倍?300?孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸 样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部 柱填
6、料对柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径色谱柱性能的影响：孔径II 由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大 条件：C8色谱柱，4.6150mm，3.5um，A溶剂，0.1%TFA水溶液；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈 水中；20min梯度，10 30%B；60C，1.5ml/min 柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I 2.3-二羟基萘 OHOHOHOH2.7-二羟基萘 min01234567mAU 010203040 VWD1 A,Wavelength=230 nm(LPF07091702.D)300
7、84084min0123456mAU 01020304050 VWD1 A,Wavelength=230 nm(LPF07090605.D)Aea2532882275Aea4003992889min01234567mAU 0510152025303540 VWD1 A,Wavelength=230 nm(LPF07091208.D)24503471min0246810mAU 510152025 VWD1 A,Wavelength=230 nm(LPF07091202.D)3944Aea1766865934TF=1.31 Brand W,AQ Column 5m,4.6mm150mm Brand
8、 Z,C18 Column 5m,4.6mm150mm Venusil MP C18 5m,4.6mm150mm Brand H,C18 Column 5m,4.6mm150mm min0123456789mAU 010203040 VWD1 A,Wavelength=230 nm(LPF07091711.D)2899Brand U,C18 Column 5m,4.6mm150mm！TF=1.42 TF=1.39 TF=1.69 TF=？流动相：甲醇：水=65：35 流速：1 mL/min 温度：温度：35 检测波长：230 nm 进样量：20 L 硅胶纯度金属含量 硅胶基质类型及发展史硅胶基
9、质类型及发展史?Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附?Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解/烧结/酸洗?杂化及表面杂化?整体柱?壳层柱 柱填料对柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度色谱柱性能的影响：硅胶纯度II 硅胶纯度金属含量硅胶纯度金属含量 d 固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响 残余硅羟基的影响 普通硅胶普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。解决方法解决方法 封尾 双层表面修饰 表面杂化 固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的
10、影响固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响 封尾 键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。缺点：缺点：不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）在pHC3C1，长链之间差别不大 反相键合相的保留行为反相键合相的保留行为 不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰 T0（尿嘧啶）P:吡啶 L:苯酚 N:N,N-二甲基苯胺 B:4-丁基苯甲酸 J:甲苯 固定相对色谱柱性能的影响：固定相对色谱柱性能的影响：基质表面特性+键合类型 键合相
11、的稳定性 键合相的稳定性键合相的稳定性?低pH值，键合相流失?高pH值，硅胶溶解 影响色谱柱寿命，方法不重现 键合类型对键合相稳定性影响键合类型对键合相稳定性影响 低pH值，键合相流失 键合类型对键合相稳定性影响（键合类型对键合相稳定性影响（II）空间位阻保护，延缓键合相流失空间位阻保护，延缓键合相流失 固定相对色谱柱性能的影响：固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性键合硅胶的稳定性 高pH值，硅胶基质溶解 pH9时，色谱柱的稳定性 固定相对色谱柱性能的影响：固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性键合硅胶的稳定性 碳杂化，延硅胶缓高pH值水解 杂化颗粒：Waters Xterra 表面
12、碳杂化示意图 pH=12 条件下的稳定性 min051015202530mAU0510152025303540 2.080 2.320 4.068 6.961 9.775 14.276min051015202530mAU0510152025303540 2.040 2.311 4.337 7.090 9.965 14.2714 amines,ACN/1%Ammonia aqueous=25%:75%,40oC,4.6 x 150 mm,5um 1h 200 h 总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件?了解目标化合物的性质：结构（官能团）、pKa、分子量、浓度范
13、围、溶解度、极性?了解色谱柱的性质?粒径，孔径，比表面积 保留强度和柱效；抗污染性?基质表面特性，键合类型保留强度，选择性，柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性?选择相应的色谱条件选择相应的色谱条件 色谱柱选择（）?替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类型相似?新方法开发：粒径：2um vs 3um vs 5um（分析时间，灵敏度，仪器，价格，寿命）内径柱长：内径3mm vs 4.6 vs 7.8（对分离影响不大，成本）；柱长与粒径相关 比表面：（低比表面耐污染，高比表面利于分离）孔径：在满足比表面前提下大孔径较好 硅胶基质表面特性：）尽可能使用高纯硅胶；）尽可能使用低酸性硅胶；）当流动相尽
14、可能使用表面杂化；）使用多硅羟基残留，可加强对于极性化合物保留或削弱对于非极性化合物保留 键合类型：取决于选择性和流动相要求；具有一定极性的（）可以作为首选尝试；耐酸：选择；耐碱：Durashell 封尾与不封尾：封尾削弱硅羟基影响；不封尾：提高硅羟基影响，增强极性物质保留，降低柱流失。min02.557.51012.51517.52022.5mAU -200204060 VWD1 A,Wavelength=254 nm(ZJZ09050416.D)5.229 5.566 7.820 8.798 9.588min02.557.51012.51517.52022.5mAU -200204060 VWD1 A,Wavelength=254 nm(ZJZ09050505.D)6.947 7.443 9.048 10.012 10.250 10.891 12.006 12.624min02.557.51012.51517.52022.5mAU -200204060 VWD1 A,Wavelength=254 nm(ZJZ09050502.D)6.928 8.534 9.660 11.515 12.077 12.830 14.463 15.740 乙腈水 乙腈水 乙腈水,KH2PO4 pH=4.2
