1、河豚毒素研究及河豚毒素研究及国家战略忽悠局YN-ZH1604号文件13524概述河豚及河豚毒素免疫应用作用机理适应性进化提纯检测技术洗脱、吸附、过滤目录页参考文献概述PART 011l河豚l河豚毒素LOGO河豚puffer fishes PROFILE河豚介绍河鲀，为硬骨鱼纲鲀科鱼类的统称，俗称河豚。自古以来中国食用的河豚皆生息于河中，因捕获出水时发出类似猪叫声的唧唧声而得名河“豚”。另有“气泡鱼”、“吹肚鱼”、“河豚鱼”、“气鼓鱼”、“乖鱼，鸡泡”等称呼。古时称“肺鱼”。河鲀为暖温带及热带近海底层鱼类，栖息于海洋的中、下层，有少数种类进入淡水江河中，当遇到外来危险时使整个身体呈球状浮上水面，
2、同时皮肤上的小刺竖起，借以自卫。常见的有红鳍东方鲀、暗纹东方鲀（T.fasciatus）、黑鳃兔鲀、凹鼻鲀、黑斑叉鼻鲀等LOGO河豚毒素性质性质l白色结晶，无味l微溶于水，不溶于有机酸剂l对酸作用稳定，没有确定熔点氨基全氢喹唑啉型化合物分子式：C11H17O8N3分子量：319LOGO河豚毒素毒性毒性是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，其毒性比氰化物还要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。毒素对肠道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神经末梢和神经中枢。l雌性雄性l冬春夏秋l卵巢脾脏肝脏血液眼睛鳃耙皮肤精巢一般肌肉中不含有河鲀毒素，但河鲀死后内脏中的毒素可渗入肌肉，此时鱼肉也含有少量毒
3、素。河鲀毒素化学性质和热性质均很稳定，盐腌或日晒等一般烹调手段均不能将其破坏，只有在高温加热30min以上或在碱性条件下才能被分解。LOGO中毒症状l肠胃症状肠胃症状恶心、呕吐、腹痛或腹泻l神经麻痹神经麻痹症状症状口唇。舌尖、指端麻木全身麻木，眼睑下唇，四肢无力，肌肉软瘫l呼吸、循环衰竭症状呼吸、循环衰竭症状呼吸困难、血压下降、瞳孔异常、言语障碍、昏迷呼吸衰竭LOGO作用机理研究表明，TTX 属小分子非蛋白类成分神经毒素，服用后首先迅速由胃肠道吸收，然后进入血液中，迅速抑制中枢神经和末梢神经系统，引发神经传导阻滞，造成神经麻痹，严重的会引发脑干神经麻痹导致呼吸循环衰竭而死亡，具有潜伏期短、死亡
4、率高的特点。深入药理研究表明，TTX 也是一种电压敏感的钠通道外口特异性阻滞剂，在较低浓度下就能通过及细胞膜上受体结合，再通过关闭机制使钠离子通道h闸门关闭，即选择性抑制钠离子通过神经细胞膜而允许钾离子、氯离子通过，具有高度专一性，使细胞膜失去可极化状态，从而抑制甚至阻断了神经-肌肉的兴奋及传导过程，导致神经肌肉活动障碍，严重者可发生麻痹状态并可引起呼吸中枢麻痹、血压下降、脉搏迟缓，最终可能因呼吸停止和循环衰竭而死亡。LOGO生物活性TTX 是一种电压敏感的 Na+通道外口特异性阻滞剂，其麻醉作用是普鲁卡因的 4 000 倍，可代替吗啡、杜冷丁起镇痛作用，且不成瘾，并有解痉、降压、抗心律失常等
5、作用。在医学方面，TTX 通过阻断快速钠离子通道来治疗某些心律失常具有潜在可能性。最新研究表明 TTX 是神经生理学、肌肉生理学和钠离子通道药理学研究的非常有用的工具。已经证明 TTX可有效治疗某些疾病如癌症晚期造成的疼痛等。虽然 TTX 是重要的选择性钠离子通道抑制剂，然而最近的研究表明，TTX 也表现出对犬类心脏细胞L 型钙离子通道的阻断作用。LOGO适应性进化在对河豚毒素没有免疫力的生物体内，钠通道的-亚基上存在河豚毒素的受体，河豚毒素及-亚基门孔附近的氨基酸残基结合，阻止钠离子进入细胞内，引起河豚毒素中毒。而河豚体内细胞的构造及其他生物不同，河豚体内还存在可以和河豚毒素结合的蛋白质，从
6、而使河豚对体内的河豚毒素具有免疫力。比较红鳍东方鲀、黑青斑东方鲀 和斑马鱼的基因序列图谱，发现红鳍东方鲀和黑青斑东方鲀骨骼肌的 Nav1.4通道发生了变异，正是这种变异使河豚具有抵抗河豚毒素的能力。红鳍东方鲀和豹纹东方鲀的变异类似，都是在 Na v 1.4 通道的 401 位点上发生了取代，取代为一个折叠程度更高的不饱和氨基酸，河豚的这些氨基酸是不及河豚毒素结合的，从而也就不能对河豚的钠通道造成影响。LOGO适应性进化通过克隆调控豹纹东方骨骼肌 Na v 1.4 通道表达的 cDNA，发现 Nav1.4通道区域401位点处存在一个不饱和氨基酸，即天冬酰胺。通过基因工程把不饱和氨基酸移植到对河豚
7、毒素敏感的小鼠骨骼肌 Na v 1.4 通道处，移植的不饱和氨基酸的折叠程度越高，小鼠抵抗河豚毒素的能力越强。当不饱和氨基酸的折叠程度大于取代位点氨基酸折叠程度的2500倍时IC50(50%Na+通道发生阻断时河豚毒素的浓度)提高至47mol/L。河豚对河豚毒素具有免疫力是基因变异的结果，更是适者生存、长期自然选择的结果。河豚对河豚毒素的适应性进化为河豚提供了更大的生存空间，也为人类研制河豚毒素中毒后的解毒药品提供了依据。LOGO分离提纯及检测方法对河豚毒素的分离提取研究首先是晶化问题。1909 年日本学者田园良纯用醋酸酸化后用铅盐沉淀法分离，再用醋酸-乙醚重结晶。1950年日学者横尾晃采用氧
8、化铝柱层析，以水为洗脱剂洗脱，得到河豚毒素的结晶。目前大多采用离子交换法、活性炭柱层析及凝胶柱层析、吸附树脂等方法分离。国际上分离河豚毒素多采用层析法。把富含毒素的样品绞碎，用醋酸浸提，浸提液经离心，合并上清液，加热除蛋白质，再减压浓缩，萃取脂肪。之后经过冷冻干燥或再减压浓缩，浓缩液经多次层析洗脱，即可得到纯度非常高的样品。国内国内分离河豚毒素的方法主要分离河豚毒素的方法主要有有l 活性炭吸附法l 苦味酸盐法的氨解l 树脂吸附洗脱法和滤膜过滤法LOGO分离提纯及检测方法LOGO河豚毒素的免疫研究河豚毒素活性部位胍基可及细胞膜上的特异性受体结合，阻止钠离子进入细胞内，降低兴奋在神经纤维上的传导速
9、度，导致神经中枢和神经末梢麻痹，血压下降，因此河豚毒素可作为止痛剂、麻醉剂和降压药等。但是在临床上使用河豚毒素剂量过大，会导致远端神经损害，神经损害可累及神经根、植物神经和中枢神经。因此，为了避免河豚毒素在临床应用中产生全身毒性反应，目前已研制出河豚毒素微胶囊，把它分散的移植到坐骨神经的细胞膜下，既能起到局部麻醉的作用，又能降低对神经系统的毒性。研发成功的河豚毒素微胶囊，可以使河豚毒素在临床上得到的广泛应用。河豚毒素及神经变性有关。用河豚毒素处理神经胶质细胞，导致692个细胞基因表达发生异常。因此，河豚毒素作为一种神经毒素，为研究基因的表达规律及神经衰退机制提供了一条新途径。另外，河豚毒素还可
10、治疗及睡眠相关的疾病。在网状脑桥嘴核和蓝斑下核内微量注射河豚毒素，它们的活性受到抑制，导致快速眼动睡眠时间和非快速眼动睡眠时间减少，证明河豚毒素能降低脑桥区的活性，影响生物的睡眠-觉醒状态，因此河豚毒素可以用来调整睡眠时间以及提高睡眠质量，为治疗失眠等顽疾提供了新思路。LOGO河豚毒素的免疫研究河豚毒素具有镇痛作用，用醋酸刺激引起小鼠腹膜炎症而产生疼痛，表现为扭体反应，微量河豚毒素或者微量河豚毒素联合小剂量的戊巴比妥钠注射到小鼠体内后，小鼠扭体频率降低。河豚毒素对器官的缺血性损伤具有保护作用，可明显降低脑梗死体积及神经功能缺失症状。河豚毒素对常规心律失常具有较好的拮抗作用，特别在抗室颤方面效果
11、显著。但是以上实验均是在小鼠或兔子身上做的实验，还没有应用到临床医学上。河豚毒素还可以用于戒毒，加拿大科学家已经应用于临床，效果比较显著。另外，河豚毒素在治疗癌症、延缓衰老和提高免疫力等方面也取得了显著的效果。LOGO参考文献1于丽华,周力,谢克勤.河豚毒素对小鼠镇痛作用的实验研究J.山东医科大学学报,1999,37(2):120.2李中华,李春英,汪晨净.TTX局部应用对家兔齿髓刺激所引起的疼痛的影响J.中国药理学会通讯,2000,17(2):47.3潘心富,黄致强.河豚药用研究概况J.药学通报,1984,19(4):40.4靳艳卿,段世明,王钧,等.侧脑室注射TTX和藜芦定对大鼠异氟醚MA
12、C的影响J.中华麻醉,2000,20(5):305.5杨文西.莨菪类抢救河豚中毒17例J.中华预防医学杂志,1990,24(6):385.6耿兴斌.654-2抢救河豚中毒成功3例报道J.中国农村药学杂志,1993,21(5):17.7王海涛,徐志.应用莨菪类药物抢救河豚鱼中毒12例临床体会J.中级医刊,1995,30(7):21.8张永贵,刘树威,张宇辉,等.河豚毒素(TTX)解毒药的研究J.脑及神经疾病杂志,1996,4(2):105.9陈西贵,张玉兰.河豚毒素中毒对中枢神经系统的影响J.国外医学卫生学分册,1995,22(2):126.10胡谦,施玉良.国产河豚毒素(TTX)单克隆抗体8A5有效地拮抗TTX对钠内流的抑制J.生理学报,1995,47(1):89.
