1、菠菜色素的提取和色素分离一、实验目的通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法。方法。通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。定的原理。二、实验原理二、实验原理 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。黄素（黄）等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素 a(C55 H72O5N4Mg)和和叶绿素叶绿素 b(C55H7O6N4
2、Mg)，其差别仅是，其差别仅是 a 中一个甲基被中一个甲基被 b 中的甲酰中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素 a 的含量通常是的含量通常是 b 的的 3 倍。倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。醚、石油醚等一些非极性的溶剂。二、实验原理二、实验原理 胡萝卜素胡萝卜素(C40H56)是具有长链结构的共轭多烯。它有三是具有长链结构
3、的共轭多烯。它有三种异构体，即种异构体，即 a-,-和和-胡萝卜素，其中胡萝卜素，其中-异构体含量最异构体含量最多，也最重要。在生物体内，多，也最重要。在生物体内，-体受酶催化氧化即形成维生体受酶催化氧化即形成维生素素 A。目前。目前-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素 A 使用，也可作为食品工业中的色素。使用，也可作为食品工业中的色素。叶黄素叶黄素(C40H56O2)是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油
4、醚中溶解度较小。较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。二、实验原理二、实验原理NNNNMgCO2CH3CH2OCHH3CH3CRCH2CH3CH3CH2CH2COOCH3CH3CH3CH3CH3叶 绿 素 a(R=CH3)叶 绿 素 b(R=CHO)二、实验原理二、实验原理CH3H3CRCH3CH3CH3CH3CH3RH3CCH3H3C-胡萝卜素（R=H）叶黄素（R=OH）CH2OH维 生 素 A三、基本操作与技术三、基本操作与技术F薄层色谱薄层色谱 薄层色谱常用薄层色谱常用TLC表示表示，又叫薄板层析，是色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重法中的一种，是快速
5、分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色质。此外，薄层色谱法
6、还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种谱之前的一种“预试预试”。薄层色谱的原理是利用吸附剂（硅胶、氧化铝等）薄层色谱的原理是利用吸附剂（硅胶、氧化铝等）对不同组分吸附能力的差异从而达到分离目的的方法。对不同组分吸附能力的差异从而达到分离目的的方法。三、基本操作与技术三、基本操作与技术薄层板的制备薄层板的制备 吸附剂：最常用硅胶吸附剂：最常用硅胶 GF254；硅胶硅胶HF254。粘结剂：一般用所羧甲基纤维素钠（粘结剂：一般用所羧甲基纤维素钠（CMC），也有用淀粉的。），也有用淀粉的。CMC 配成配成1水溶液使用。水溶液使用。制板：以小板的制备为例，将硅胶加制板：以小板的制备为例，将硅胶加 1
7、 CMC，调成桨状（在平铺玻，调成桨状（在平铺玻璃板上能晃动但不能流动），将其涂在载玻片上（璃板上能晃动但不能流动），将其涂在载玻片上（75 25），为使其），为使其坦平，可将载玻片用手端平晃动，致坦平为止，放在干净平坦的台面上，坦平，可将载玻片用手端平晃动，致坦平为止，放在干净平坦的台面上，晾干之后放入晾干之后放入110烘箱活烘箱活 化化1小时即可使用。小时即可使用。三、基本操作与技术三、基本操作与技术点样点样 点样用的毛细管为内径点样用的毛细管为内径1mm的管口平整的毛细管，将样品溶于的管口平整的毛细管，将样品溶于低沸点的溶剂（乙醚、丙酮、乙醇、四氢呋喃等）配成低沸点的溶剂（乙醚、丙酮、乙
8、醇、四氢呋喃等）配成1溶液。溶液。点样前，可先用铅笔在小板上距一端点样前，可先用铅笔在小板上距一端5mm处轻轻划一横线，作为处轻轻划一横线，作为起始线，然后用毛细管吸取样品在起始线上小心点样，如需重复点样，起始线，然后用毛细管吸取样品在起始线上小心点样，如需重复点样，则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点。若在同一块板上点几个样，则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点。若在同一块板上点几个样，样品点间距离为样品点间距离为5mm以上。以上。三、基本操作与技术三、基本操作与技术展开展开 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑
9、。素来考虑。薄层的展开在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放入色谱器薄层的展开在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放入色谱器中（小板可用广口瓶代替），使色谱器内空气饱和中（小板可用广口瓶代替），使色谱器内空气饱和5-10min，再将点好，再将点好试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位置必须在展开剂液面试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位置必须在展开剂液面之上，当展开剂上升到薄层的前沿（离前端之上，当展开剂上升到薄层的前沿（离前端 5-10mm）或多组分已明）或多组分已明显分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位置后，即可显分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位置后，
10、即可显色。显色。三、基本操作与技术三、基本操作与技术显色显色 如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置。点），显色
11、后，立即用铅笔标出斑点的位置。计算比移值计算比移值 记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）。）。三、基本操作与技术三、基本操作与技术距离溶剂前沿至原点中心的点中心的距离溶质最高浓度中心至原fR四、主要仪器与试剂 F仪器仪器:研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸F试剂试剂:硅胶硅胶 G，甲醇，石油醚（，甲醇，石油醚（60-90），丙酮，乙酸乙），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶酯，菠菜叶五、实验装置图五、实验装置图薄层板在层析缸中展开六、实验流程图六、实验流程图菠 菜菠 菜 汁萃 取
12、 液研 磨过 滤石 油 醚-甲 醇萃 取浸 膏水洗 涤、蒸 馏薄 层 层 析Rf值分别用展开剂（分别用展开剂（a）石油醚）石油醚-丙酮丙酮=8:2（体积比）和（体积比）和（b）石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯=6:4（体积比）（体积比）展开，比较不同展开剂系展开，比较不同展开剂系统的展开效果。统的展开效果。七、实验关键及注意事项 F薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。整光洁。F点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板面；展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否面；展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得Rf值值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。置。八、思考题 F 在一定的操作条件下为什么可利用在一定的操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？值来鉴定化合物？F 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？F 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？
