1、微生物学实验微生物学实验生命科学学院生命科学学院实验一实验一显显 微微 镜镜 的的 使使 用用细菌的简单染色细菌的简单染色(3学时学时)实验内容涉及教材：实验实验内容涉及教材：实验2、7、12等。等。一一 目的要求目的要求 1 复习普通光学显微镜的结构、功能和操作技术；学复习普通光学显微镜的结构、功能和操作技术；学习油镜的工作原理和使用方法；习油镜的工作原理和使用方法；2 掌握细菌的制片和简单染色技术，观察球菌和杆菌掌握细菌的制片和简单染色技术，观察球菌和杆菌等在光学显微镜下的基本形态特征；等在光学显微镜下的基本形态特征；3 建立建立“无菌概念无菌概念”，体会无菌操作的重要性。，体会无菌操作的
2、重要性。二二 实验器材实验器材 1 菌种菌种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。2 溶液和试剂溶液和试剂 香柏油、二甲苯、吕氏碱性美兰染液、水等。香柏油、二甲苯、吕氏碱性美兰染液、水等。3 仪器和其它用品仪器和其它用品 普通光学显微镜、载玻片、酒精灯、火柴、擦镜纸、接普通光学显微镜、载玻片、酒精灯、火柴、擦镜纸、接种环、废液缸、滤纸、纱布等。种环、废液缸、滤纸、纱布等。三三 基本原理基本原理 普通光学显微镜普通光学显微镜 微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察到，显微镜微生物个体微小，必
3、须借助显微镜才能观察到，显微镜是微生物学者不可缺少的基本工具。是微生物学者不可缺少的基本工具。普通光学显微镜利用目镜、物镜两组透镜系统来放大成普通光学显微镜利用目镜、物镜两组透镜系统来放大成像，常称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组像，常称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组成。成。1 机械装置机械装置 镜座和镜臂：镜座支持整个显微镜，镜臂支持镜筒部分。镜座和镜臂：镜座支持整个显微镜，镜臂支持镜筒部分。镜筒：上接目镜，下接转换器，分为单筒和双筒两种。镜筒：上接目镜，下接转换器，分为单筒和双筒两种。转换器：是一个金属圆盘，上面装有转换器：是一个金属圆盘，上面装有3-4个物镜，可
4、以使个物镜，可以使物镜通过镜筒和目镜组成一个放大系统。物镜通过镜筒和目镜组成一个放大系统。载物台：放置镜检标本，中间有载物台：放置镜检标本，中间有通光孔。载物台上装有标本夹和标本通光孔。载物台上装有标本夹和标本推进器，在推动器上具有刻度，能够推进器，在推动器上具有刻度，能够确定标本位置，便于找到观察视野。确定标本位置，便于找到观察视野。调焦装置：调焦装置：调节物镜与标本间距调节物镜与标本间距离的结构。离的结构。粗动螺旋粗动螺旋微动螺旋微动螺旋2 光学系统光学系统 物镜：安装在转换器上，将物体第一次放大，决定显微镜物镜：安装在转换器上，将物体第一次放大，决定显微镜的成像质量和分辨能力。的成像质量
5、和分辨能力。目镜：安装在镜筒上端，由两块透镜组成，将物镜成的像目镜：安装在镜筒上端，由两块透镜组成，将物镜成的像再次放大，但是不增加分辨力，目镜放大倍数过大，反而影响再次放大，但是不增加分辨力，目镜放大倍数过大，反而影响观察效果。观察效果。聚光器：由聚光镜和虹彩光圈组成，聚光器：由聚光镜和虹彩光圈组成，调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，使调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，使适当强度的光线照射到标本上。适当强度的光线照射到标本上。光源：安装在镜座内，通过开关控制。光源：安装在镜座内，通过开关控制。滤光片：可见光由不同波长的光线组滤光片：可见光由不同波长的光线组成，使用滤光片可以得到所需的一种波长
6、成，使用滤光片可以得到所需的一种波长的光线，提高分辨率、增加反差。的光线，提高分辨率、增加反差。一台显微镜由机械装置和光学系统组成，其中物镜是显一台显微镜由机械装置和光学系统组成，其中物镜是显微镜最重要的部件。微镜最重要的部件。物镜通常有三种，低倍镜、高倍镜、油镜。低倍镜的放物镜通常有三种，低倍镜、高倍镜、油镜。低倍镜的放大倍数一般为大倍数一般为4-10、高倍镜的放大倍数一般为高倍镜的放大倍数一般为40-45、油油镜为镜为95-100，是放大倍数最大的物镜。，是放大倍数最大的物镜。油镜的工作原理油镜的工作原理1 提高分辨率提高分辨率 0.5 l l最小可分辨距离最小可分辨距离=n sin q
7、q 分辨率是决定显微镜观察效果的重要指标，分辨率是决定显微镜观察效果的重要指标，显微镜分辨显微镜分辨率越高，能达到的最小可分辨距离越小。率越高，能达到的最小可分辨距离越小。为所用光源波长；为所用光源波长；n=载载玻片与物镜间介质的折射率。玻片与物镜间介质的折射率。镜口角是光线投射到物镜上的最大角度，镜口角是光线投射到物镜上的最大角度，q q为物镜镜口角半为物镜镜口角半数，取决于物镜的直径和工作距离。数，取决于物镜的直径和工作距离。n：玻片与物镜间介质的折射率。玻片与物镜间介质的折射率。显微镜数值孔径显微镜数值孔径(numerical aperture,NA)：指镜口角一半：指镜口角一半的正弦与
8、载玻片物镜间介质折射率的乘积，是决定物镜性能的的正弦与载玻片物镜间介质折射率的乘积，是决定物镜性能的最重要指标。最重要指标。空气空气(n=1.0)、水、水(n=1.33)、香柏油、香柏油(n=1.52)，介质折射率，介质折射率提高提高 数值孔径值提高数值孔径值提高 分辨率提高。分辨率提高。0.5 l l最小可分辨距离最小可分辨距离=n sin q q 光线在穿过折射率不同的介质光线在穿过折射率不同的介质时发生折射。时发生折射。2 提高照明度提高照明度空气空气(n=1.00)玻璃玻璃(n=1.52)很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光
9、线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。对于油镜：工作介质是香对于油镜：工作介质是香柏油。柏油。空气空气 (n=1.00)玻璃玻璃 (n=1.52)香柏油香柏油(n=1.52)对于低倍镜和高倍镜：介对于低倍镜和高倍镜：介质是空气质是空气 细菌的简单染色细菌的简单染色 细菌个体微小，无色透明，不经过染色，常常不容易观细菌个体微小，无色透明，不经过染色，常常不容易观察。经过染色后，菌体与背景颜色形成鲜明的颜色对比，便察。经过染色后，菌体与背景颜色形成鲜明的颜色对比，便于在显微镜下观察细菌的形态、大小和排列方式。于在显微镜下观察细菌的形态、大小和
10、排列方式。利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于生物染色的碱性染料不是碱而是一种盐，碱性染料用于生物染色的碱性染料不是碱而是一种盐，碱性染料电离时染料离子带正电荷，而细菌蛋白质的等电点较低，当电离时染料离子带正电荷，而细菌蛋白质的等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液时常带负电荷，这样带它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液时常带负电荷，这样带负电荷的细菌很容易与带正电荷的染料离子结合而使细菌着负电荷的细菌很容易与带正电荷的染料离子结合而使细菌着色。色。常用的碱性染料有美兰、结晶紫、碱性复红、番红等。常用的碱性染料有美兰、结晶紫、碱性
11、复红、番红等。室温或烘干室温或烘干1小滴生理盐水小滴生理盐水四四 操作步骤操作步骤 细菌的简单染色细菌的简单染色 涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗镜检镜检2-3次次美兰，美兰，2-3min滤纸吸干滤纸吸干 显微镜使用及细菌基本形态观察显微镜使用及细菌基本形态观察1 观察前准备观察前准备 显微镜安置：置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验显微镜安置：置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为台边沿约为10cm左右，镜检者姿势要端正。左右，镜检者姿势要端正。光源调节：适当调节聚光器的高度可以改变视野亮度，光源调节：适当调节聚光器的高度可以改变视野亮度，但是一般情况下聚光器在使用中都是调到
12、最高位置。但是一般情况下聚光器在使用中都是调到最高位置。调节目镜间距和屈光度。调节目镜间距和屈光度。聚光器数值孔径的调节：调节方法见教材，但是做普通聚光器数值孔径的调节：调节方法见教材，但是做普通观察时可以不用调节。观察时可以不用调节。瞳瞳 距距 调调 节节屈光度调节：可以适应双眼视力有差异的观察者。屈光度调节：可以适应双眼视力有差异的观察者。2 低倍镜观察低倍镜观察 养成良好的调焦习惯，先从侧面注视，小心调节物镜靠近养成良好的调焦习惯，先从侧面注视，小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，以防操作失误而损坏镜头。标本，然后用目镜观察，以防操作失误而损坏镜头。3 高倍镜观察高倍镜观察 一般情况下
13、，当物像在一种物镜中清晰聚焦后，转动转换一般情况下，当物像在一种物镜中清晰聚焦后，转动转换器将其它物镜转到工作位置，物像保持基本准焦状态，称为物器将其它物镜转到工作位置，物像保持基本准焦状态，称为物镜的同焦镜的同焦(parfocal)。利用同焦现象，在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作利用同焦现象，在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时，仅用微动螺旋即可对物像清晰聚焦，从而避距离短的物镜时，仅用微动螺旋即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗动螺旋时可能的错误操作而损坏镜头。免由于使用粗动螺旋时可能的错误操作而损坏镜头。4 油镜观察油镜观察 注意不要因为在下降物镜镜头时用力过猛或者调
14、焦时误注意不要因为在下降物镜镜头时用力过猛或者调焦时误将粗动螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片。将粗动螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片。不可以将高倍镜转动经过加油镜油的区域。不可以将高倍镜转动经过加油镜油的区域。5 显微镜用毕后处理显微镜用毕后处理 下降载物台，取下载玻片；分三步用擦镜纸清理镜头。下降载物台，取下载玻片；分三步用擦镜纸清理镜头。将显微镜还原。包括将光源灯亮度调至最低后关闭；将将显微镜还原。包括将光源灯亮度调至最低后关闭；将最低放大倍数物镜转到工作位置；载物台及聚光器降至最低最低放大倍数物镜转到工作位置；载物台及聚光器降至最低位置。位置。五五 注意事项注意事项 1 严格、标准的进行无菌操作。严格、标准的进行无菌操作。2 涂片时取菌量要适宜而且要涂抹均匀。涂片时取菌量要适宜而且要涂抹均匀。3 注意油镜头的清理。注意油镜头的清理。4 注意显微镜用后还原。注意显微镜用后还原。六六 实验报告实验报告 1 请绘制观察到的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌形态图。请绘制观察到的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌形态图。2 什么是物镜的同焦现象？在显微观察时有什么意义？什么是物镜的同焦现象？在显微观察时有什么意义？Many Thanks
