1、实验十七 姊妹染色单体色差方法 一、实验目的 1.子解姐妹染色单体差别染色技术的原理和制作SCE标本的方法。2.通过SCE标本的观察，掌握SCE计数方法。四、实验器具和药品 1.用具：2mL和1mL灭菌注射器，吸管，移液管，离心管，量筒，烧杯，无菌青霉素瓶，试剂瓶，培养瓶，酒精灯，载玻片，天平，紫外灯（15W），离心机，恒温培养箱，显微镜。2.药品配制：RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、链霉素，吉姆萨染液等。五、实验步骤1.配制培养液 在无菌条件下，用20mL的青霉素瓶分装5mL培养液，其中RPMI1640占80%，小牛血清占1520%；PHA0.2mL；青霉素100
2、单位/mL；链霉素100微克/毫升。最后用3.5%NaHCO3调节pH至7.27.4。2.加入BrdUrd 每5mL的培养液中加入BrdUrd 0.1mL，最终浓度为10ug/mL。3.加入0.3mL静脉血培养 每瓶培养液中加入0.3mL静脉血，轻轻摇匀，用黑布避光，立即置37温箱中培养。4.加入秋水仙素继续培养 培养72h左右，加入秋水仙素0.4-0.8ug/mL，继续培养4h。5.按常规收集细胞制片 用0.075mol/L KCl或蒸馏水低渗20min，用甲醇冰醋酸31配制的固定液固定两次，每次15min，用气干法制片，一天以后将染色体制片放入7080烤箱中烘烤12h，或放在37温箱中存放
3、备用。6.染色体标本的差别染色方法处理 (1)碱的热溶液处理:将染色体标本浸在88的1mol/L NaH2PO4(pH为8.0)的溶液中，处理20min，取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规Giemsa染色5min，再用蒸馏水冲洗，干燥，观察。(2)紫外灯照射诱发：染色体标本在37条件下搁置24小时后取出，放在4548的水浴锅上，覆盖一层2SCC溶液（0.3mol/L NaCl,0.03mol/L枸橼酸钠），15W紫外灯照射20-30min，灯管与载玻片之间距离为6厘米（照光期间防止2SCC溶液干涸）。照射完毕，用蒸馏水冲去2SCC，用3%Giemsa(pH6.8磷酸缓冲液稀释)染色510min，水
4、洗，气干后镜检。7.镜检 在普通光学显微镜下观察，可见姐妹染色单体呈现鲜明的深浅不同的颜色。人体淋巴细胞姐妹染色单体互换 图片六、注意事项 1.培养基组成、培养液的酸碱度、培养温度或培养时间等因素略加变动，可适用于其他一些哺乳动物、鸟类或两栖类动物淋巴细胞的培养，用以观察它们的姐妹染色单体色差。2.BrdUrd溶液最好现配现用，一次使用不完，必须有黑布避光，4冰箱保存。3.BrdUrd在培养开始时加入，或在培养后的24小时加入均可。4.用紫外灯照射诱发姐妹染色单体互换时，如紫外灯功率大，W数高，照射的时间就相应地减少。七、实验结果 1.SCE的计数方法 2.选细胞轮廓完整，染色体数为整二倍体的中期象进行SCE分析
