1、Transposition1、通常、通常DNA自发变化都是通过自发变化都是通过 作用很快作用很快 被校正，但在极少情况下，被校正，但在极少情况下，DNA将变化的部分保将变化的部分保 留下来导致永久的序列变化，称为：留下来导致永久的序列变化，称为：。2、DNA复制过程中发生的复制过程中发生的DNA变化称为变化称为 。损伤的修复方式有损伤的修复方式有 ;,其中以其中以 为主。为主。填填 空空DNA修复修复突变突变损伤损伤错配修复错配修复 直接修复直接修复 切除修复切除修复重组修复重组修复SOS系统系统切除修复切除修复1、紫外线照射对、紫外线照射对DNA分子的损伤主要是分子的损伤主要是:()A.碱基
2、替换；碱基替换；B.磷酸酯键断裂；磷酸酯键断裂；C.碱基丢失；碱基丢失；D.形成共价连接的嘧啶二聚体。形成共价连接的嘧啶二聚体。选选 择择DA.引物长度较短；引物长度较短；B.合成方向是合成方向是53；C.冈崎片段长度短；冈崎片段长度短；D.有多个复制起始点；有多个复制起始点；E.DNA复制的速度较慢复制的速度较慢(50dNTP/s).B3、着色性干皮病是人类的一种遗传性皮肤病、着色性干皮病是人类的一种遗传性皮肤病,患患 者皮肤经阳光照射后易发展为皮肤癌者皮肤经阳光照射后易发展为皮肤癌,该病的该病的分子机理是：分子机理是：()A.细胞膜通透性缺陷引起迅速失水细胞膜通透性缺陷引起迅速失水;B.在
3、阳光下使温度敏感性转移酶类失活在阳光下使温度敏感性转移酶类失活;C.因紫外线照射诱导了有毒力的前病毒因紫外线照射诱导了有毒力的前病毒;D.细胞不能合成类胡萝卜素型化合物细胞不能合成类胡萝卜素型化合物;E.DNA修复系统有缺陷。修复系统有缺陷。E6第六章第六章 DNA的重组与转座的重组与转座78 9 1012 Holliday中间体通过中间体通过分支移动分支移动产生异源双链产生异源双链DNA。异构化后异构化后通过不同切割方式产生不同重通过不同切割方式产生不同重组分子：组分子：如果切开的链如果切开的链并非原来断裂的并非原来断裂的链链，重组体异源双链区的两侧，重组体异源双链区的两侧来自来自不同亲本不
4、同亲本DNA，称，称拼接重拼接重组体（左）组体（左），但如切开的链与但如切开的链与原来断裂的是原来断裂的是同一条链同一条链，重组，重组体含一段体含一段异源双链区异源双链区，其两侧，其两侧来自来自同一亲本同一亲本DNA，称片段重称片段重组体（右）组体（右）13141516171819202122 23 Chi位点位点 RecA蛋白蛋白252627 2829303132333435363738394041A.为整合和切除过程为整合和切除过程B.为共同的核心序列为共同的核心序列限制性内切酶的发现能识别并切断外来能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外分子的某些部位，使外来来DNA失去活性，限制外来
5、噬菌体的繁殖，把失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为这类酶称为限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶。限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯Werner Arber瑞士巴塞尔Biozentrum大学1929年-内萨恩斯内萨恩斯Daniel Nathans美国霍普金斯大学医学院1928年-1999年史密斯史密斯Hamilton O.Smith美国霍普金斯大学医学院1931年-荣获荣获1978年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用v限制性核酸内切酶能够识别限制性核酸内切酶能够识别DNA上的
6、特定碱基序上的特定碱基序列列并从这个位点切开并从这个位点切开DNA分子。分子。v第一个核酸内切酶第一个核酸内切酶EcoRI是是Boyer实验室在实验室在1972年发现的，它能特异性识别年发现的，它能特异性识别GAATTC序列序列，将双，将双链链DNA分子在这个位点切开并产生具有分子在这个位点切开并产生具有粘性末端粘性末端的小片段。的小片段。限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶的命名原则限制性内切酶的命名原则p命名原则命名原则：p取取属名的第一个字母大写属名的第一个字母大写，取，取种名的前两个种名的前两个字母小写字母小写，构成，构成基本名称基本名称。该种中发现的不。该种中发现的不同的酶按照顺序编
7、号同的酶按照顺序编号I,II,III等。如存在等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。变种和品系，取变种或品系的一个字母。若若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子体遗传因子。属名属名 +种名种名 +株名株名 +流水号流水号 流感噬血杆菌流感噬血杆菌d株株 （Haemophilus influengae d）Hind Hind Hind 5AAGCTT 3 Hind 3TTCGAA 5命命 名名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感流感嗜血杆菌嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶限制性内切酶
8、分类限制性内切酶分类n限制性核酸内切酶可分为三大类：限制性核酸内切酶可分为三大类：I类类 II类类*III类类I 类限制性内切酶类限制性内切酶n能识别专一的核苷酸顺序，并在识能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是分子中的双链，但是切割的核苷酸切割的核苷酸顺序没有专一性顺序没有专一性，是随机的。，是随机的。n代表代表EcoB、EcoKII 类类(型型)限制性内切酶限制性内切酶n能能识别专一的核苷酸顺序识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的，并在该顺序内的固定位置上切割双链。固定位置上切割双链。nII 型限制性内切酶的识别顺序是一个
9、型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对回文对称顺序称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向从这个轴朝二个方向“读读”都完全相同。都完全相同。G AATTCCTTAA GEcoR IIII类类(型型)限制性内切酶限制性内切酶n有专一的识别顺序有专一的识别顺序，但，但不是对称的回文顺序不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。切割双链。n很少能产生完全切割的片段，因而不具备实很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值。用价值。限制性内切酶产物限制性内切酶产物 钝端（平端）钝端（平端）粘
10、性末端粘性末端几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端内切酶所识别的序列及其酶切末端酶切反应酶切反应1）加入）加入DNA；2）加入）加入Buffer；3）加入酶；）加入酶；4）37保温保温1hr或过夜；或过夜；5）反应终止，）反应终止，65加热、加加热、加入入EDTA、或加入苯酚。、或加入苯酚。1.浓缩的限制性内切酶用浓缩的限制性内切酶用1限制酶缓冲液稀释。限制酶缓冲液稀释。2.限制性内切酶多限制性内切酶多保存于保存于50%甘油中甘油中，于，于-20是稳是稳定的。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶定的。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即
11、将酶放被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回回-20冰箱。冰箱。3.尽量减少反应体积尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总，但要确保酶体积不超过反应总体积的体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。，否则酶活性将受到甘油的抑制。4.在切割大量在切割大量DNA时，时，通常延长时间通常延长时间可使所需的酶量可使所需的酶量减少。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶减少。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。电泳以检测消化进程。5.注意星号酶切活力。注意星号酶切活力。酶切反应酶切反应v星号活性星号活性：限制性内切酶在一些特定条件：限制性内切酶在一些特定条件下使用时，
12、对于底物下使用时，对于底物DNA的特异性降低，的特异性降低，即即可以把原来识别的特定的可以把原来识别的特定的DNA序列不同序列不同的碱基切断的碱基切断。v星号活性出现的频率、根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都有星号活性。DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a.DNA的粘性末端;b.DNA的平末端;c.化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。v仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连连接酶进行接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能工程的要
13、求，只有将它们连接到具备自主复制能力的力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。v具备自主复制能力的具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的分子就是分子克隆的载体（载体（Vector）。病毒病毒、噬菌体噬菌体和和质粒质粒等小分等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。子量复制子都可以作为基因导入的载体。载体载体（Vector）理想载体的基本条件：理想载体的基本条件：polylinker重组重组DNA的主要载体的主要载体v质粒质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份，绝立于染色体并能自主复制
14、的遗传成份，绝大多数质粒都是由大多数质粒都是由环形双链环形双链DNA组成的复组成的复制子。制子。质粒质粒载体特点载体特点1、至少有一个、至少有一个复制起点复制起点，因而至，因而至少可在一种生物体中自主复制。少可在一种生物体中自主复制。2、至少应有一个、至少应有一个克隆位点克隆位点，以供，以供外源外源DNA插入。插入。3、至少应有一个、至少应有一个遗传标记基因遗传标记基因，以指示载体或重组以指示载体或重组DNA分子是分子是否进入宿主细胞。否进入宿主细胞。4、具有、具有较小的分子量较小的分子量和和较高的拷较高的拷贝数贝数。p pB BR R3 32 22 2B Ba am mH HI IS Sa
15、al lI IH Hi in nd dI II II IP Ps st tI IS Sc ca aI IA Am mp pr ro or ri i(4 4.3 36 6 k kb b)遗传标记基因遗传标记基因 标记基因的作用标记基因的作用:1）指示）指示外源外源DNA分子（载体或重组分子）是分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞否进入宿主细胞;这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（Ampr，Tetr，Kanr），），也可以是非选择性的（如也可以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源指示外源DNA分子分子是否插入载体分子形成是否插入载体分子形成了重组子了重组子。重组重组DNA载体的选择
16、载体的选择 选择载体的几个重要参数选择载体的几个重要参数 （1）实验对象）实验对象 （2）实验性质）实验性质 （3）载体容量）载体容量 （4）合适克隆位点）合适克隆位点 （5）载体的稳定性）载体的稳定性 （6）载体）载体DNA制备的难易制备的难易 （7）外源基因表达产物产量、产物特点等）外源基因表达产物产量、产物特点等载体容量载体容量 M13mp载体载体 4 kb 细菌质粒载体细菌质粒载体 10kb 载体载体 23kb COS质粒载体质粒载体 48kb P1载体载体 95 kb pYAC载体载体 1000 kb合适的克隆位点合适的克隆位点 单克隆位点和多克隆位点单克隆位点和多克隆位点载体分类载
17、体分类按功能分按功能分 1.克隆载体克隆载体;2.表达载体表达载体.按宿主性质按宿主性质 1.原核载体原核载体:质粒载体、粘粒、噬菌粒、质粒载体、粘粒、噬菌粒、噬菌体、噬菌体噬菌体、噬菌体M13等等 2.真核载体真核载体:逆转录病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺病毒、昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒 3.穿梭载体穿梭载体 常用质粒载体常用质粒载体 1.pBR322、pUC 18/19、pUC118/119、pGEM、pBluescript、pBluescript SK/KS等 2.pET、pGEMEX、pGEX等 3.pALTER等 常用质粒宿主常用质粒宿主 HB101、DH5、TG1、JM系列等 BL21
18、（DE3）等 转化转化(transformation):质粒及重组质粒质粒及重组质粒;转染转染(transfection):病毒及重组病毒病毒及重组病毒;转导转导(transduction):噬菌体及重组噬菌体噬菌体及重组噬菌体;感受态感受态:受体细胞处于易于接受外源受体细胞处于易于接受外源DNA的状态的状态.原理原理:（1）遗传物质的传递）遗传物质的传递 （2）受体菌的选择与改造）受体菌的选择与改造重组重组DNA转入受体细胞转入受体细胞AmpTetAmN2H77 78转座特征：转座特征：能从基因组的一个位点转移到另一位点，从一个复能从基因组的一个位点转移到另一位点，从一个复制子转移到另一复制
19、子；制子转移到另一复制子；不以独立形式存在不以独立形式存在(如噬菌体或质粒如噬菌体或质粒)，而在，而在基因组基因组内由一个部位直接转移到另一部位内由一个部位直接转移到另一部位；转座子编码自身转座酶，每次转座子编码自身转座酶，每次移动携带转座必需基移动携带转座必需基因因一起在基因组内跃迁，又称一起在基因组内跃迁，又称跳跃基因跳跃基因；转座频率很低且插入随机，不依赖转座子转座频率很低且插入随机，不依赖转座子(供体供体)和和靶位点靶位点(受体受体)间序列同源性；间序列同源性；转座子可插入到一个转座子可插入到一个结构基因结构基因或或调节基因调节基因序列内，序列内，引起引起基因表达产物改变基因表达产物改
20、变。79 80 81ISIS82 转座酶活性是转座酶活性是识别靶部位和转座子末端识别靶部位和转座子末端，并并引起转座。引起转座。转座子末端转座子末端可视为转座酶的部分底物，可视为转座酶的部分底物，转座转座酶水平的改变酶水平的改变能控制转位因子的转位频率。能控制转位因子的转位频率。83 转座机制转座机制8485转座引起的遗传学效应转座引起的遗传学效应86转座子作用：转座子作用：用于用于难以筛选基因难以筛选基因的转移；的转移；作为作为基因定位的标记基因定位的标记；筛选插入突变；筛选插入突变；构建特殊菌株构建特殊菌株；克隆克隆难以进行表型鉴定难以进行表型鉴定的基因。的基因。87 真核生物的转座子真核
21、生物的转座子 真核转座子有真核转座子有两类两类：从从DNA到到DNA的转座子的转座子；以以RNA介导的逆转座子等介导的逆转座子等。玉米的控制元件玉米的控制元件 1952年年McClintock对玉米对玉米粒色粒色与与斑点斑点变化遗传实验提出生物变化遗传实验提出生物基因组中有基因组中有可移动控制因子可移动控制因子【有不稳定诱变效应，影响某些有不稳定诱变效应，影响某些遗传性状，可沿染色体移动，在不同染色体间跳跃，其转位遗传性状，可沿染色体移动，在不同染色体间跳跃，其转位可使被控制基因表达改变可使被控制基因表达改变】。真核生物基因组中广泛存在各种转座子。真核生物基因组中广泛存在各种转座子。88 真核
22、转座子与原核相似，转座依赖于转座酶，两端真核转座子与原核相似，转座依赖于转座酶，两端有有IR，靶位点随机，被交错切开，插入转座子后经，靶位点随机，被交错切开，插入转座子后经修复形成两侧正向重复。修复形成两侧正向重复。玉米控制因子有三个系统：玉米控制因子有三个系统：Ac-Ds系统系统（activator-dissociation system）即）即激活激活-解离系统解离系统；Spm-dSpm（suppressor-promoter-mutator）即）即抑制抑制-促进促进-增变系统；增变系统；Dt系统系统（dotted system）即）即斑点系统斑点系统。8990逆转座子生物学意义逆转座子生
23、物学意义 （1 1）对基因表达的影响）对基因表达的影响 逆转座子对宿主基因表达的影响逆转座子对宿主基因表达的影响与其整合部位与其整合部位有关有关，当插入到基因编码序列和启动子时使基，当插入到基因编码序列和启动子时使基因失活；插入因失活；插入3和和5非翻译区或内含子时影响非翻译区或内含子时影响转录、后加工或翻译，及表达组织特异性和发转录、后加工或翻译，及表达组织特异性和发育阶段性。育阶段性。逆转座子如果插入到基因上游的调控区逆转座子如果插入到基因上游的调控区，如启，如启动子和增强子区，则可使动子和增强子区，则可使邻近沉默的基因得到邻近沉默的基因得到表达表达。91（2 2）逆转座子介导基因重排）逆
24、转座子介导基因重排 逆转座子自身在复制时易发生重排逆转座子自身在复制时易发生重排 分散在真核基因组中的分散在真核基因组中的大量逆转座子是大量逆转座子是基因组的不稳定因素基因组的不稳定因素，能引起基因组序，能引起基因组序列的删除、扩增、倒位、移位及断裂等列的删除、扩增、倒位、移位及断裂等重排。重排。92（3 3）逆转座子在进化中的作用）逆转座子在进化中的作用 逆转座子除能促进基因组的流动，有利于生物逆转座子除能促进基因组的流动，有利于生物遗传的多样性外；它们分散在基因组中，成为遗传的多样性外；它们分散在基因组中，成为进化的种子进化的种子，当遇到合适的基因组序列环境，当遇到合适的基因组序列环境，即可即可通过突变形成新基因或基因的结构域通过突变形成新基因或基因的结构域，或，或是是与先存的基因互配成为新的调节因子与先存的基因互配成为新的调节因子。本章思考题：本章思考题：1.名词解释：名词解释：DNA重组、同源重组、转座子、重组、同源重组、转座子、插入序列（插入序列（IS）。）。2.DNA重组包括哪些过程重组包括哪些过程?3.简述复制型转座与非复制型转座的机制。简述复制型转座与非复制型转座的机制。4.DNA转座引起了什么遗传学效应转座引起了什么遗传学效应?
