1、时晓芳2016.6.8：将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊。也称类脂小球或液晶微囊。磷脂亲水的头部磷酸骨架水溶性分子（胆碱、丝氨酸、季胺盐等）疏水的尾部胆固醇脂质体两条脂肪酸链，（10-24个C原子，0-6个双键）磷脂结构示意图OH胆固醇的结构图双分子结构：磷脂分子的亲水端呈弯曲的弧形，形似“手杖”，与胆固醇分子的亲水基团 相结合，形成“U”形结构。两个“U”形结构相对排列，则形成双分子结构卵磷脂与胆固醇在脂质体中的排列形式胆固醇与磷脂的排列示意图脂质体形成示意图脂质体形成示意图 LiposomesMicelles 脂质体脂质体 胶束胶束组成组成磷脂和胆固醇磷脂和胆固醇表面活性剂表面
2、活性剂结构结构双分子层双分子层单分子层单分子层中心区域中心区域水相，可容纳亲水性药物水相，可容纳亲水性药物疏水区，可容纳疏水性药物疏水区，可容纳疏水性药物单室脂质体小单室SUV 20-100nm大单室LUV 100-1000nm多室脂质体MLV 15m 洋葱式、管状、球形、椭球形 结构和粒径多囊脂质体MVV 15m 缓释效应和储库效应洋葱式管状球形、椭球形 多囊Akbarzadeh et al.Nanoscale Research Letters.2013,8:102脂质体材料中性磷脂 负电荷磷脂（酸性磷脂）正电荷脂质 胆固醇（Ch)大豆甾醇及其葡萄糖苷磷脂酰胆碱（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）鞘
3、磷脂（SM）磷脂酸（PA）磷脂酰甘油（PG）磷脂酰肌醇(PI)磷脂酰丝氨酸(PS)硬脂酰胺（SA）胆固醇衍生物大豆甾醇葡萄糖苷(SG）大豆甾醇SS不同材料，形成不同结构的脂质体不同材料，形成不同结构的脂质体磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PCPC)(a)(a)全饱和磷脂全饱和磷脂 （紧密排列）（紧密排列）(b)(b)非饱和磷脂非饱和磷脂（不能紧密列）（不能紧密列）磷脂脂肪链的饱和度对磷脂膜排列的影响磷脂脂肪链的饱和度对磷脂膜排列的影响天然的PC a.从蛋黄、大豆、牛心脏和脊髓提取b.每一种PC具有不同长度、不同饱和度的脂肪链 植物性PC的脂肪链具有高度不饱和性
4、动物性PC的脂肪链大部分是饱和的合成的PC 二棕榈酰胆碱（DPPC)、二硬脂酰胆碱(DSPC)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC)POOOOOOORRONH3+特性：头部基团小；非饱和的PE容易形成非双层结构型 -六角相（制备特殊脂质体）六角相六角相 磷脂酰乙醇胺（磷脂酰乙醇胺（PEPE）磷脂酰乙醇胺磷脂酰乙醇胺(phosphatid ethanolamine,PE)特性：酰胺键和羟基基团之间形成氢键相互作用，因此，比PC具有更高秩序的胶相。SMSMPOOOON HORNC H3C H3C H3OH+鞘磷脂（sphingomyelin,SM）磷脂酸(phosphatidic acid,PA)磷脂酰
5、肌醇(phosphatidyl inositol,PI)磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine,PS)POOOOHOOORROPOOOOOOORROOHOHOHOHHOPOOOOOOORROCOOHNH3C+负电荷磷脂（酸性磷脂）电荷增加脂质体透皮吸收 磷脂酰胺(Stear amide,SA)胆固醇衍生物CDBA和CTBBALiu XM,Yang B,etc.Biochim Biophys Acta,2005,1720(1-2),28-34.Liu XM,Yang B,etc.Chem Mater,2005,17(11),2792-2795.包裹物质脂溶性药物 定位于双分子层脂质
6、膜间两性化合物 定位于水相与膜内部交界磷脂上 水溶性药物 包裹在水相不能包裹物质在水相和有机溶剂中都不溶的物质 在两种介质中溶解性都非常好的物质 单室脂质体多室脂质体脂质体与细胞的相互作用：吸附、脂交换、内吞、融合在护肤品领域，一般是指用卵磷脂类形成双分子层微囊，把需要被皮肤吸收利用的原料包裹在其中；将对皮肤有养护作用的原料，用卵磷脂包裹后，有这样几个好处：提高吸收效率 脂质体细胞膜的磷脂双分子层的结构非常接近，提高脂质体的经皮吸收效率。对被包裹物质提供保护 脂质体可以将油性原料分散在亲油层中，也可以将水性原料包裹在脂质体球心。而磷脂则可以将有效成分与空气隔离开，使有效成分更长久的保存，延长产
7、品的保质期，也可以延长涂抹在皮肤上后的有效时间。降低配方难度 由于卵磷脂独特的亲油亲水性，脂质体可以随意分散在水中，不增加乳化工作。亮剑之旅拓展训练课程磷脂药物复合物磷脂凝胶脂质体前体脂质体 形式柔性脂质体 角质脂质体醇质体脂质体变换形式化妆品：脂质体的透皮吸收和缓释作用是重点，修复性，保护性，增效性膏霜类化妆品一般加多室或多囊脂质体相变温度(phase transition temperature,Tc)脂质体升高温度至一定温度 膜的物理性质改变膜的横切面增加、双分子层厚度减少、膜流动性增加 脂质双分子层中酰基侧链排列改变 有序排列变为无序排列 相变温度TcTc以下时，为“胶晶态”（脂肪链全
8、反式，排列紧密，刚性和厚度增加）Tc以上时，为“液晶态”（脂肪链伸缩、弯曲、外扭）磷脂发生相变时，“胶晶态”“液晶态”“液态”共存，出现相分离，使膜的流动性增加，易导致内容物泄漏。相变温度与脂质体膜稳定性形貌粒度Zeta电位包封率磷脂含量Fig 1 脂质体的TEM测试项目样品制备缺点局限性常规TEM 1.样品一般需要使用磷钨酸染色（负染）2.将样品用稀释到合适的浓度，1Wt%左右 3.用毛细管滴到铜网上，晾干或烘干1.脂质体干燥过程中会发生结构变化。2.对小颗粒分辨率不高。100nm左右。常规SEM 1.将含有脂质体的样品滴在干净的硅片上面 2.晾干或者烘干 3.对其进行喷金处理（增强样品的导
9、电性）1.只能看表面结构，不能区分脂质体和其它纳米颗粒2.脂质体不导电，需要喷金处理。AFM1.把样品稀释为浓度1Wt%左右2.样品滴在云母片上3.放置待溶剂挥发干后进行测试只能看表面结构，X,Y轴不灵敏，分辨率低探针难控制Fig 1 脂质体的TEMFig 3 脂质体的AFMFig 2 脂质体的SEM常规电镜法缺点：1.样品干燥后失去原貌 2.分辨率不高，不能区分脂质体和其他纳米颗粒。Aline F Xavier,Daiana K Deda2,et al.IJABPT,2016,7(2),303-313Ruan L P,Zhang H Y,Luo H L,et al.Science in Ch
10、ina Series B:Chemistry,2009低温扫描电镜样品制备及观测过程样品独立制备与分析：镀膜仪真空镀膜后保持真空状态转移到SEM，在制备与分析之间无污染样品转移。保留样品原貌分辨率较高优势缺点：只能观测表面结构Cryo-TEM低温透射电镜样品制备及观测过程高压冷冻仪可与超薄切片机及冷冻样品杆配合，进行低温透射电镜观测测试方法：1.将蘸在铜网上的样品溶液或分散液的液膜 急速冷冻，即在铜网上形成玻璃态水膜，无冰晶产生。2.在样品传输、进样、TEM观察的过程中始终 保持低温。对于囊泡类样品的观察，通常使用这种方法。保留样品原貌分辨率较高优势可观测不同类型的脂质体内部结构+外部资源：中
11、国科学院上海生命科学研究院中国科学院上海巴斯德研究所同济大学Sugikawa K et al.Angewandte Chemie International Edition,2016.Jonas Gustafsson et al.Biochimica et Biophysica Acta 1995类冷冻切片制样法：类似冷冻切片与细胞切片制备的方法，对化妆品样品进行固定包埋（石蜡包埋），然后进行切片，然后将其放在铜网或硅片上进行制样，对脂质体成像。分辨率能达到纳米级别 细胞切片法常常用来区分亚细胞结构样品制备简单，成本低，资源广脂质体的形貌大小的表征独创的方法ACS applied materi
12、als&interfaces,2015,7(14):7526-7533.Yigong Shi al.Structure of a yeast spliceosome at 3.6-angstrom resolutionJ.Science,2015,349(6253):1182-1191.2013年，冷冻电镜技术在照相技术和软件分析的图像处理技术方面取得突破性进展成为施一公实验室诺奖级工作-剪切体的结构解析的关键性工具诺贝尔奖热门2014 年全球科技十大进展结构生物学的突破性工具最高分辨率达2.2 优势区分不同结构和类型的蛋白质分辨率达到原子水平SCIENCE 348 1147-1151(201
13、5)FEBS Journal 280(2013)2845区分不同结构和类型的脂质体局限性：外部资源少国家蛋白质科学中心-上海 胆固醇与脂质体异性结合，对胆固醇进行荧光修饰，通过confocal 观测荧光脂质体结构 缺点：分辨率较低，可能无法达到几十纳米级别超高分辨率荧光显微镜优点：专属性，排除其他物质干扰，外部资源多 Sung T C et al.Scientific reports,2016,6.Shi X et al.Polymer Chemistry,2013超高分辨率荧光显微镜（分辨率达到分子级别1nm 左右，2014年诺贝尔化学奖）STORM 技术的开创者庄小威2014诺贝尔化学奖S
14、tefan W.HellW.E.MoernerEric BetzigX.Zhuang，Science 317 1749-1753(2007)Nature Methods 3793-795(2006)Science319 810-813(2008)低分辨荧光显微镜和超高分辨荧光显微镜图片的对比局限性：外部资源少 优点：突破光学极限的分辨率：1nm 左右，具有专属性，可作为通用的方法北大工学院席鹏课题组上海交大李小卫课题组Seeing is Believing 分辨率非常重要大小形貌结构Conclusion:一、假设脂质体加入化妆品体系之后仍然稳定存在，则使用Cryo-TEM或者切片法检测，这两种
15、方法保留了脂质体的原貌，理论上可以分辨出脂质体的双层结构。受配方体系中其他添加剂的影响不大，而且对体系纯度要求不高。二、对于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法观测不到脂质体,不确定是否稳定存在于体系中，可以尝试使用荧光法。该方法对样品纯度没有要求。如果在共聚焦显微镜不能看到完整的脂质体形状，说明脂质体极大可能已经被破坏，那么这样的脂质体在体系中发挥不了增溶的作用，已经没有太大的实用价值。三、如果在共聚焦显微镜下可以看到完整的脂质体形状，可以进一步尝试高分辨Cryo-TEM 或者超高分辨荧光显微镜进行观察。对于复杂样品体系，需要多种表征方法一起反复确认，以保证观测结果的可靠性。原理：
16、在不同的角度上测量散射光的强度，得到样品粒度分布体积分布与数量分布之间的转换关系u 颗粒平均粒径表示方法 体积（D4,3）表面积（D3,2）数量u 不同颗粒均值对颗粒分布的 不同特征敏感脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法方法原理特点与适用范围缺点HPLC法参照磷脂含量测定适用范围广，可同时用于磷脂含量和包封率测定/透析法利用半透膜分子大小差别，通过及时更换外相达到分离的目的简单，稳定性好，可处理大量样品，适合小粒径，稳定性好的脂质体耗时较长，所耗介质较多微柱离心法利用游离药物与含药脂质体的重力差异进行分离，计算包封率所需样品少，适用于水溶性和脂溶性药物，分离时间短，可
17、用于中间过程检测离心时间长1h以上；重现性差；离心力导致脂质体中物质渗漏凝胶柱层析法利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离适用于脂溶性药物，较大脂质体粒径（200nm）所需样品量大，操作繁琐，洗脱时间长造成渗漏荧光淬灭反应法1.具有荧光的物质,在高浓度时发生“自淬灭”,在某一低浓度范围内,荧光强度又和浓度成正比。2.高浓度包封于脂质体内水相中荧光物质保持自淬灭无荧光产生,而未包封在脂质体外水相中浓度降低荧光重现3.通过荧光检测器测定荧光值,准确测定最初脂质体包封和未包封的荧光物质浓度计算得到包封率可处理大量样品，检测物需有荧光性物质或可生成荧光性物质，直接测定需注意荧光物质的酸碱
18、溶解性，荧光物浓度不可过高（荧光强度低浓度下成线性关系）电子自旋共振光谱法当添加顺磁性试剂如铁氢化物时,外部标记物的电子自旋谱带会显著加宽;还可以利用包裹在脂质体内部的标记物与游离标记物间扩散系数的不同来测定包封率所需样品量小,不需分离脂质体和游离药物,准确、稳定,可避免分离带来的误差需加入顺磁性试剂(铁分析波长248.3nm,此波长被检测物不能有吸收)或分子标记物核磁共振法1HNMR外相标记的游离药物显示出pH敏感的化学位移，而内水相标记的药物则没有。根据游离药物的量和总量计算得到包封率适用于水溶性和脂溶性药物，结果精确需要对药物进行标记样品处理方法：1.用透析法，超速离心法或凝胶柱层析法分离游离A。2.对脂质体进行破乳后测包裹的A含量。包封率（%）=W包/W总 100%包封率（%）=（1-W漏）/W总100%
