1、鼠单抗的改造本章主要内容本章主要内容概述C区的人源化-嵌合抗体V区的人源化-改型抗体小分子抗体概述鼠源性单抗在临床应用中存在的问题n具免疫原性 激发免疫应答，消弱疗效，产生副作用激发免疫应答，消弱疗效，产生副作用n与FC片段相关的功能不能有效活化 如活化补体，活化补体，ADCC,调理作用调理作用n半衰期短概述鼠源性单抗的改造原则n保持原来抗体的特异性与亲和力；保持原来抗体的特异性与亲和力；n尽量减小其免疫原性。尽量减小其免疫原性。发展阶段nC区的人源化-嵌合抗体 鼠抗鼠抗V区与人抗区与人抗C区组装而成区组装而成nV区的人源化 改型抗体改型抗体n小分子抗体C区的人源化-嵌合抗体 1984 Mor
2、rison首次报道首次报道依据 90%90%的人抗鼠抗体反应针对鼠抗的人抗鼠抗体反应针对鼠抗C C区区基本手段n从杂交瘤中获得鼠抗V区基因n从人B细胞获得人抗C区基因n将二者克隆到表达载体n转染哺乳动物细胞，进行表达C区的人源化-嵌合抗体主要形式n嵌合IgGn嵌合Fabn嵌合F(ab)2C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 如何构建？鼠抗基因鼠抗基因人抗基因人抗基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3VHCH1CH2CH3VLCLC区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w鼠抗V区基因
3、的获得 RT-PCR方法方法 引物设计：依据引物设计：依据VH和和VL的组成的组成-由由4个相对个相对保守的保守的FR和和3个个CDR，设计（注意酶切位点）。，设计（注意酶切位点）。C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w鼠抗V区基因的获得 提取提取mRNA：从杂交瘤或脾细胞中获得：从杂交瘤或脾细胞中获得 RT-PCR法克隆法克隆VH和和VL基因基因C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w人抗C区基因的获得 C C区的选择：区的选择：依据目的不同选择依据目的不同选择C区区即抗体即抗体亚型，如
4、补体活化能力，亚型，如补体活化能力，ADCC等等 IgG1的补体活化及的补体活化及ADCC作用强于作用强于 IgG3，而而IgG4没有或很弱。没有或很弱。与与Fc受体结合力受体结合力IgG1和和IgG3 最强最强 IgG1和和 IgG4半衰期较长半衰期较长C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w人抗C区基因的获得 引物设计：引物设计：C区基因，设计时注意酶切位点区基因，设计时注意酶切位点 提取提取mRNA：从：从B细胞中获得细胞中获得 RT-PCR法克隆法克隆C区基因区基因C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人I
5、gGn表达载体的构建 构建嵌合构建嵌合L链与链与H链的重组质粒链的重组质粒 注意必须是真核表达载体注意必须是真核表达载体C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn嵌合抗体的表达 转染哺乳动物细胞进行表达转染哺乳动物细胞进行表达 哺乳动物细胞的选择：骨髓瘤细胞，哺乳动物细胞的选择：骨髓瘤细胞，COS细细胞，胞，CHO细胞等。细胞等。几种常用宿主细胞的表达特点COS细胞 短暂表达较为理想，几天内即可装配成功短暂表达较为理想，几天内即可装配成功骨髓瘤细胞 最主要的宿主细胞，如最主要的宿主细胞，如NS0CHO细胞 常用宿主细胞，常用宿主细胞，300-900mg/Ln嵌
6、合嵌合IgG优点与不足优点与不足优点优点保留了鼠抗的特异性与亲和力保留了鼠抗的特异性与亲和力基本解决鼠抗免疫原性所致的不良反应基本解决鼠抗免疫原性所致的不良反应能有效激活补体及能有效激活补体及ADCC延长半衰期延长半衰期改善药代动力学特性改善药代动力学特性 已批准上市的治疗性单抗已批准上市的治疗性单抗2001淋巴瘤淋巴瘤CD52人源化抗体人源化抗体Campath2000淋巴瘤淋巴瘤CD33人源化抗体人源化抗体Mylotarg1998RSV感染感染RSV F蛋白蛋白人源化抗体人源化抗体Synagis1998乳腺癌乳腺癌HER-2人源化抗体人源化抗体Herceptin19981999炎症性肠病类炎
7、症性肠病类风湿关节炎风湿关节炎TNF-人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体Remicade1998移植排斥移植排斥CD25人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体Simulect1997淋巴瘤淋巴瘤CD20人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体Rituxan1997移植排斥移植排斥CD25人源化抗体人源化抗体Zenapax1994冠心病冠心病血小板血小板人人-鼠嵌合鼠嵌合FabReoPr o1995大肠癌大肠癌17-1A鼠单抗鼠单抗Panorex1986移植排斥移植排斥CD3鼠单抗鼠单抗OKT3批准日期批准日期适应症适应症靶向抗原靶向抗原抗体种类抗体种类抗体名称抗体名称嵌合嵌合IgG优点与不足优点与不足不足不足仍具一定抗原性仍具
8、一定抗原性分子量较大，组织穿透能力较差分子量较大，组织穿透能力较差清除较慢清除较慢 在导向诊断与治疗方面受限在导向诊断与治疗方面受限C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体nFabw克隆鼠抗V区基因w克隆人抗CH1和C基因w重组w构建表达载体w转染宿主细胞，表达嵌合抗体C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体nF(ab)2w化学偶联法 通过化学试剂将Fab连接成一个双价抗体分子w重组末端修饰法 在Fab的C端额外连接一个Cys残基：效率较低 连接（CPP）3，效率可达70%C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体n优点w可原核表达 包涵体：高效，可达30%，复性难
9、 分泌表达：周质腔，可溶有活性，避免降解，降低毒性 成功范例：抗CD3的Fab 700mg/L 人源化抗体HuMab4125-8 Fab 2g/LC区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体n优点w可原核表达w良好的药物载体w血液清除率高w导向诊断与治疗C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体n缺点w无ADCC,CDCw滞留时间短w仍具一定抗原性V区的人源化 嵌合抗体不能完全解决抗原性问题 V区的人源化将鼠抗CDR移植到人抗V区中的FR区。构建策略nCDR移植抗体 最为普遍最为普遍wCDR序列组成及构象分析,确定策略w人源FR模板的重构V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗
10、体w移植策略w完全CDR移植 将鼠抗全部6个CDR，克隆到人抗相应FR区上V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w移植策略w部分CDR移植 外源性CDR仍具潜在抗原性 研究表明，轻链的CDR1,CDR2和重链CDR3是维持抗原结合所必需。将必需CDR移植到人抗FR上，得到人源化抗体V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w移植策略wSDR转移 研究发现，CDR中的只有特定区域（SDR）参与了表位的识别和结合。SDR包括暴露在外与表位结合的残基，维持V区构象的残基。将SDR移植到人抗相应位置上，得到人源化抗体V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构 原则：鼠CD
11、R能正确折叠，保持原来构象 包括：从同源抗体或抗体共同序列中选择人源FR；根据已知信息，确定FR中起关键作用的氨基酸V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构w鼠源FR替换模板的选择 采用统一的人源FR作为替换模板：一般选择人抗最常见的VHIII和VI的框架区作替换模板。好处：模板信息明确，避免盲目 不足：不易保持鼠抗CDR的天然构象，可能降低或丧失亲和力。V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构w鼠源FR替换模板的选择 在抗体序列库中搜寻与鼠抗FR最大同源性的人源FR作为替换模板 好处：减少需要更改的氨基酸数目，更好保持CDR需要的空间环境。V区
12、的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构w人FR模板的残基变换 FR残基对表位结合也有影响 FR为CDR形成正确构象提供平台 因此，在替换时尽量保留与CDR有相互作用，或与抗体亲和力密切相关，或对FR空间结构起关键作用的残基。V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构w人FR模板的残基变换 如何确定这些残基？规范结构法、分子模拟，随即突变，序列分析，抗体库技术等，需晶体数据和三维结构分析数据。V区的人源化构建策略n鼠抗V区的表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样。w前提：鼠抗V区抗原性源于表面残基w研究表
13、明，表面残基携带绝大部分表位。表面形式的差异是人鼠抗体间的主要差别。w将鼠源性残基替换成人源的，模拟人抗的表面轮廓，逃避人免疫攻击。V区的人源化构建策略n鼠抗V区的表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样。w好处：改变的残基少，可减少CDR与FR间的不相容性。w正在完善之中w争论热点：鼠抗引起的人抗鼠抗体反应是由表面残基还是由内部残基引起？V区的人源化构建策略n表位导向的人源化抗体 利用表位导向选择进行鼠抗人源化要点：首先保留鼠抗H或L链；特定抗原体外筛选它与人抗L或H链组合成的杂合抗体，找出维持其活性的人抗L或H链；利用筛出的人抗L或H链，再筛出
14、人抗H或L链，二者组合成完全人源抗体。基础：建立完整的人抗体库 正在探索，前景广阔V区的人源化技术方案n鼠抗V区基因的获得nPCR法筛选阳性克隆n设计 鼠抗氨基酸序列分析：判断CDR区，特殊FR残基，糖基化位点，其它重要残基V区的人源化技术方案n设计 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区序列的选择：固定或同源匹配的固定或同源匹配的FR区区 L/H FR来源相同还是不同来源相同还是不同 选择人亚群一致还是特殊选择人亚群一致还是特殊FR 确定选择人确定选择人FR方案方案 抗体亚类的考虑抗体亚类的考虑V区的人源化技术方案n设计 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区
15、序列的选择 鉴别所选FR中公认的比较重要的回复突变 供体和受体序列分析 重新确认FR序列的选择并设计人源化抗体序列 小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体Single Chain Fv ScFv 由抗体由抗体VH、VL基因通过一段连接肽基因基因通过一段连接肽基因拼接后，表达形成的重组蛋白。拼接后，表达形成的重组蛋白。具有抗原结合能力的最小抗体片段，可具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开段效应功能的实际应用中开展研究和应用。展研究和应用。小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体Si
16、ngle Chain Fv ScFvn基本环节w从从杂交瘤或脾细胞中杂交瘤或脾细胞中提取提取mRNAwRT-PCR法获得法获得VH和和VL基因基因 w设计设计linker,将其连接在一起将其连接在一起w克隆到表达载体克隆到表达载体w基因表达基因表达小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFvn方法要领w原则 保持抗体分子的可溶性保持抗体分子的可溶性 设计理想的设计理想的linker序列序列wlinker序列设计的要点 长度与性质不应干扰长度与性质不应干扰V区的折叠，不干扰对区的折叠，不干扰对抗原的结合抗原的结合小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFvn方法要
17、领w原则wlinker序列设计的要点 长度：长度：不应过短或过长，一般不应过短或过长，一般15AA，如，如 (Gly4Ser)3小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFvn方法要领w原则wlinker序列设计的要点 不干扰功能区折叠：残基侧链选择，不宜过不干扰功能区折叠：残基侧链选择，不宜过 大，如大，如Gly,Ser 亲水性大小，如亲水性大小，如Thu小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFvn优点 分子量小,易于穿透组织到达靶器官 易于构建和生产n不足 易于被清除 小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体双链抗体dsFv 在在VH和和VL适当部位各引
18、入适当部位各引入1个个Cys，形成，形成二硫键二硫键 结合能力和稳定性均优于结合能力和稳定性均优于ScFv 组织穿透和血清清除率平衡组织穿透和血清清除率平衡 小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体双价小抗体diabody 缩短缩短linker，使两分子，使两分子ScFv形成双价小分形成双价小分子抗体子抗体 结合性能优于单价分子结合性能优于单价分子 小分子抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体迷你抗体minibody 将人的将人的CH3连在连在ScFv羧基端，形成迷你抗羧基端，形成迷你抗体体 半衰期较长，组织穿透和血清清除率平衡半衰期较长，组织穿透和血清清除率平衡 免疫治疗最具潜力载体免疫治疗最具潜力载体小结本章鼠源单抗的改造，皆是建立在免疫本章鼠源单抗的改造，皆是建立在免疫动物基础之上的。动物基础之上的。杂交瘤细胞中，抗体已经选择与亲和成杂交瘤细胞中，抗体已经选择与亲和成熟，熟，mRNA丰度高，所得抗体亲和力及丰度高，所得抗体亲和力及阳性率高阳性率高,但只能制备单一特异性抗体但只能制备单一特异性抗体
