1、 宏基因组学研究已渗透到各个领域,包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。宏基因组学宏基因组学 也称微生物环境基因组学,环境基因组学，元基因组学,生态基因组学。环境基因组学建立在对疾病病因认识的基础上,深入探讨环境胁迫-基因、基因-基因间交互作用。其目标是研究环境胁迫对机体遗传变异的过程和机理,包括发掘环境应激和应答基因的多态性,探究这些多态性基因的功能及其与患病风险的关系,其与毒理基因组学密切相关,是在人类基因组基础上发展的功能基因组学内容之一。为什么要研究为什么要研究宏基因组学宏基因组学呢？呢
2、？99%以上的微生物未(难)被纯培养,对微生物世界的认识集中在不到1%的微生物上 人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的功能的认识远远落后于对其个体的认识 环境基因组学的研究方法环境基因组学的研究方法 以基因组学技术为依托 主要的程序包括主要的程序包括:1、从环境样品(例如土壤)中直接提取 DNA;2、将 DNA克隆到合适的载体中;3、将载体转化到宿主细菌建立环境基因组文库;4、对得到的环境基因组文库进行分析和筛选。由于环境基因组的高度复杂性由于环境基因组的高度复杂性 ,需要需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中
3、的有用基因。和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为4类:第 1类基于核酸序列差异分析(序列驱动)；第 2类基于克隆子的特殊代谢活性(功能驱动)；第 3类基于底物诱导基因的表达；第 4类基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其它技术。序列分析法序列分析法 需要根据已知的基因和基因表达产物的保守序列设计引物和探针，PCR是序列分析中最常用的技术。对鉴定新的基因成员有一定的局限性,但它已被有效地用于鉴定系统发育学中的标志基因(如 16S rRNA基因)和带有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、葡萄糖酸还原酶和腈水合酶等)。序列分析法序列分析法 微序列技术(Micr oarray)采用集约化
4、和平面处理原理,在微小片基上高密度而有序地排列大量基因片段、EST或寡核苷酸片段,从而形成 DNA微矩阵,又称基因芯片。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是在焦磷酸盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔,将基因组 DNA进行随机切割,批量地进行整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 106组以上的基因组序列,比 Sanger法要快100倍,提高了测序的效率。焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术 由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。原理：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合
5、与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5-磷酰硫酸、荧光素。脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)DNA聚合酶（能和DNA模板的下一个碱基配对）添加到测序引物的3末端 （释放）焦磷酸(PPi)ATP硫酸化酶加入 APS 特异的检测峰 （微弱光检测）ATP氧化荧光素（产生可见光）加入荧光素 鸟枪法测序(Shotgun sequencing)将一条完整的目标序列随机打断成小的片段,分别测序,然后利用计算机根据序列间的重叠关系进行排序和重新组装,并确定它们在基因组中的正确位置。优点：为
6、筛选新的天然产物提供了一种可选择的途径,从中挖掘上百万个新基因,揭示不可培养微生物的代谢途径.缺点：耗费大,需大量人力和物力。与个体微生物基因相比,对序列片段进行分析则极为困难。功能筛选法功能筛选法 方法一：对具有特殊功能特殊功能的克隆子进行直 接检测；方法二：基于异源基因的宿主菌株异源基因的宿主菌株与其突突 变体变体在选择性条件下功能互补生互补生 长长的特性进行。以活性测定活性测定为基础,通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能特殊功能的克隆.依赖于功能基因功能基因或编码功能蛋白编码功能蛋白在外源宿主中的表达表达。代谢相关基因或酶基因往往在有底物存底物存在在的条件下才表达,反之
7、则不表达,SIGEX即利用这个原理来筛选目的代谢基因。第一步第一步：以 p18GFPp18GFP为载体构建宏基因组文库；第二步第二步：在无底物情况下以异丙基 2 D硫代半乳糖苷 (IPTG)为诱导物去除阴性克隆和绿色荧光蛋白 基因(gfp)表达的克隆子；第三步第三步：在培养基中添加底物诱导底物诱导代谢关基因的表达；第四步第四步：根据 gfp基因的表达从宏基因克隆库中筛选出表表 达代谢基因达代谢基因的克隆子,利用荧光激活细胞分离仪荧光激活细胞分离仪 (FACS)(FACS)从琼脂培养平板上将GFP表达的克隆子分 离出来。通过 SIP实验实验使参与特定代谢过程(例如甲烷氧化)的生物基因组富集,克隆
8、从 SIP实验中获得的13C标记的核酸标记的核酸,从而构建一个因吸收了特定的基质特定的基质而在环境中执行特定代谢功能的微生物宏基因组文库,这极大地减少了需要筛选的克隆数量。海表层水样 为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物多样性和复杂性,宏基因组学研究将大大促进人们对它的认识。极端环境水体(如酸性矿水、深海)由于其苛刻的物理化学条件,使得其中的微生物群落也较为独特；利用环境基因组学对其开展微生物生物群落结构及生理代谢对环境变化响应的研究,将促进我们更好地理解这些极端环境生态系统并对其加以调控和利用。从土壤宏基因组文库中获得新编码基因是该技术的主要功能所在,已发现的新基因主要有生物催化生物催化剂基因剂基因、抗生素抗性基因抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因编码转运蛋白基因 土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物催化剂的发现,包括腈水解酶腈水解酶和淀粉酶淀粉酶(Rondon et al.,2000)、蛋白酶蛋白酶、氧化还原酶氧化还原酶(Knietsch et al.,2003)、脂肪酶脂肪酶、酯酶(Ki m et a l.,2004;2006)等,并且在此基础上获得新酶的许多特征信息.
