1、 转录后调控转录后调控 microRNA的研究进展分子遗传毒理实验室分子遗传毒理实验室1ppt课件Outlineso 引言引言o miRNA简介简介o miRNA功能功能o miRNA的研究方法的研究方法o miRNA and SNPs2ppt课件 基因组基因组 转录组转录组 蛋白组蛋白组The study of proteins expressed by genomesCompletion of the sequencing of the 1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins
2、in the human genomeOnly 2-5%of proteins in human genome have been identified3ppt课件转转 录录 transcriptionso 转录是指DNA指导的RNA合成。o 反应是以DNA为模板，在RNA聚合酶催化 下，以四种三磷酸核苷（NTP）即ATP、GTP、CTP及UTP为原 料，各种核苷酸之间的3、5磷酸二酯键相连进行的聚合反应。合成反应的方向为53。o 转录作用过程可以分为三个阶段：起始、延长及终止。4ppt课件转录后的调控转录后的调控 regulations 转录作用产生出的 mRNA、tRNA、rRNA及小分子
3、RNA的初级转录本全是前体RNA，而不是成熟的RNA，它们没有生物学活性，还要在酶的作用下，进行加工才能变为成熟的，有活性的RNA。调控方式：调控方式：1.5末端帽子的生成 2.3末端多聚A尾的生成 3.剪接作用 4.RNA编辑 5.甲基化修饰 6.microRNA5ppt课件 UGA 帽状结构 UAA 定位信号 多聚A尾5 m7GpppNm AUG UAG AAUAAA poly(A)35非编码区 编码区 3非编码区真核生物真核生物mRNA的一般结构的一般结构 structures6ppt课件 一些基因组中蛋白编码部分与非编码部分的比例一些基因组中蛋白编码部分与非编码部分的比例 生物生物 基
4、因组长度基因组长度 蛋白编码部分蛋白编码部分 非编码部分非编码部分 基因数基因数 （kbp）（）（）（）（）真细菌 U.urelyticum 751 88 12 577 E.coli 4,639 84 16 4,000 M.leprae 3,268 73 27 2,584 古细菌古细菌 P.horikoshii 1,739 87 13 1,636 M.jannaschii 1,665 83 17 1,599 S.solfataricus 2,992 77 23 2,610 真核生物真核生物 E.cuniculi 2,900 90 10 2,000 S.cerevisae 12,000 71 2
5、9 5,651 S.pombe 12,463 57 43 4,824 A.thaliana 115,410 29 71 25,500 C.elegans 97,000 27 73 18,424 D.melanogaster 180,000 13 87 13,600 H.sapiens 3,000,000 2 98 24,5007ppt课件Coding RNA mRNA中的编码区（ORF)Non-coding RNA(ncRNA)除ORF以外的所有RNA品种和片段RNA的分类的分类8ppt课件 ncRNA的数量反转座子基因占基因组的45可变剪接占多外显子基因的4160 反向转录的占基因总数的10
6、20最新估计的蛋白质基因数为最新估计的蛋白质基因数为24500个，个，占基因组的约占基因组的约1.5%9ppt课件19981998年年109109次香山会次香山会议中国科学家提出议中国科学家提出了了RNARNA组计划组计划10ppt课件PNAS,December 19,2000 vol 97 no.26 14035-14037 11ppt课件RNomics的内涵的内涵研究所有以研究所有以RNA为终产物基因的为终产物基因的时空表达谱和其生物学含义时空表达谱和其生物学含义12ppt课件欧美已启动以非编码RNA为主要目标的科学计划 欧盟的欧盟的“RNARNA调控网络与健康和疾病调控网络与健康和疾病”
7、计划计划 （RNA in health and disease“RibonetRNA in health and disease“Ribonet”)”)美国国家人类基因研究所提出美国国家人类基因研究所提出“DNA DNA 百科全书百科全书”计计划划 (Encyclopedia of DNA elements)(Encyclopedia of DNA elements)。中国的中国的“调控调控RNARNA与人类疾病与人类疾病”973973计划（屈良鹄）计划（屈良鹄）中国的中国的“表观遗传学表观遗传学”973973计划（裴钢）计划（裴钢）13ppt课件(I)MicroRNA 简介(1)长度为21n
8、t左右核苷酸的内源性单链小分子RNA；(2)存在65nt左右的发夹结构前体；(3)基因座位在蛋白质基因间隔区；(4)其DNA序列在近源物种间高度保守。miRNA具有十分重要的调控功能，它们主要参与基因转录后水平的调控。能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解（植物中较为常见）或者抑制其翻译（动物中较为常见），从而影响了靶mRNA的表达。目前发现miRNA是一个庞大的小分子调控RNA家族，广泛存在于各种动植物中，参与细胞增殖和分化、细胞凋亡、胚胎发育、形态建成以及疾病发生等一系列重要的生命过程。最近发现一系列与肿瘤发生相关的和人类病毒编码的miRNA，揭示miRNA在哺乳动物基因
9、表达调控中具有重要作用。14ppt课件microRNA的发现与发展 19931993年，年，Dr.Victor R.AmbrosDr.Victor R.Ambros 在线虫中发现了第一个在线虫中发现了第一个miRNAmiRNA lin4lin4，与线虫的发育相关。，与线虫的发育相关。Cell 75:843(1993)20012001年，在线虫、果蝇和人年，在线虫、果蝇和人cDNAcDNA文库中鉴定出文库中鉴定出9696种与种与lin-4lin-4和和let-7let-7相似的长度约为相似的长度约为212122nt22nt的非编码小分子的非编码小分子RNARNA。Science 294:853-
10、864(2001)microRNAmicroRNA首先在线虫中发现，首先在线虫中发现，9 9年后发现在多种生物中发挥基因调年后发现在多种生物中发挥基因调控作用，引起科学界广泛关注。控作用，引起科学界广泛关注。Nature 420:732(2002)20022002年，年，MicroRNAMicroRNA赢得赢得ScienceScience杂志评选的十大科技突破第一名。杂志评选的十大科技突破第一名。Science 298:2296(2002)至至20052005年年9 9月，在动物、植物、病毒中已鉴定出月，在动物、植物、病毒中已鉴定出 miRNAmiRNA 共共 2909 2909 个个 htt
11、p:/www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna15ppt课件小鼠小鼠(245)大猩猩大猩猩(86)水稻水稻(173)人细胞巨化病毒人细胞巨化病毒(9)鸡鸡(122)秀丽线虫秀丽线虫(114)黑腹果蝇黑腹果蝇(78)Epstein Barr virus(5)人类人类(321)家犬家犬(6)拟南芥拟南芥(117)爪蟾爪蟾(7)斑马鱼斑马鱼(362)哺乳动物哺乳动物植物植物脊椎动物脊椎动物病毒病毒部分已发现的部分已发现的microRNANature 431(7006):350-355,2004.16ppt课件计算机预测各种生物中计算机预测各种生物中miRNA基因的数目
12、基因的数目计算机预测各种生物中miRNA靶基因的数目Some major computational approaches used to identify animal miRNA genesnameSpeciesNumber of genes Ref.MiRscanC.elegans120Genes Dev,2003Human180-255Science,2003MiRseekerDrosophila110Genome Biol,2003MIRFINDERA.thaliana91-95PNAS,Genome Biol,2004Phylogenetic shadowingHuman976Ce
13、ll,2005Summary of major programs for the identification of animal miRNA targetsNameSpeciesNumber of targetRef.TargetScan,TargetScanSVertebrates442Cell,2003PatScan A.thaliana19 newMol Cell,2004Conserved Seed PairingHuman30%human genomeCell,2005Motifs in 3UTRHuman5000 human geneNature,2005PicTarVerteb
14、rates200/every miRNANature genetics,200517ppt课件miRNAs的重要特点:时序特异性与组织特异性斑马鱼胚胎发育过程中斑马鱼胚胎发育过程中9090种种miRNAsmiRNAs的表达的表达谱谱(microarray(microarray)。miRNAsmiRNAs在受精后早期一直在受精后早期一直到卵裂开始到卵裂开始(12hpf)(12hpf)并不表达，受精后一天陆并不表达，受精后一天陆续表达，直到器官发生基本完成（续表达，直到器官发生基本完成（96hpf)96hpf)，大，大多数多数miRNAsmiRNAs 的表达达到最高峰。的表达达到最高峰。Scien
15、ce 309(5732):310-311,2005.哺乳动物哺乳动物miRNAsmiRNAs的组织特异性的组织特异性Nat.Rev.Genet.5(7):522-31,2004.18ppt课件(II)miRNA的表达及作用机制 Lin-4Lin-4和和let-7let-7，由前体加工而来；成熟分子通过与各自靶基因，由前体加工而来；成熟分子通过与各自靶基因lin-14lin-14和和lin-41 mRNA 3UTRlin-41 mRNA 3UTR不完全反义互补不完全反义互补,抑制抑制lin-14lin-14和和lin-lin-41 mRNA41 mRNA的翻译。的翻译。20012001年，发现年
16、，发现RNAiRNAi中中siRNAsiRNA的成熟酶的成熟酶DicerDicer也是也是lin-4lin-4和和let-7let-7形成形成所必需，提示所必需，提示RNAiRNAi和和miRNAmiRNA途径存在交叉。途径存在交叉。20022002年，发现拟南芥的年，发现拟南芥的miRNA-39miRNA-39与靶基因与靶基因mRNAsmRNAs完全互补，并导完全互补，并导致致mRNAsmRNAs在互补区中间切断。提示在互补区中间切断。提示miRNAmiRNA功能只取决于它与靶功能只取决于它与靶mRNA mRNA 3UTR3UTR之间的互补程度。之间的互补程度。20032003年，发现年，发
17、现pre-rRNApre-rRNA(核糖体核糖体RNA)RNA)的形成过程中的一类的形成过程中的一类RNaseRNase IIIIII类核酸酶类核酸酶DroshaDrosha负责负责 pri-miRNAspri-miRNAs的加工。的加工。20032003年，发现年，发现pre-miRNApre-miRNA的出核运输依赖于的出核运输依赖于Exportin-5Exportin-5。20042004年，发现年，发现pri-miRNAspri-miRNAs末端有末端有poly(Apoly(A)尾；注入尾；注入alpha alpha amanitinamanitin(蝇蕈素蝇蕈素)使人类细胞的使人类细
18、胞的pri-miRNAspri-miRNAs水平剧减。提示水平剧减。提示miRNAsmiRNAs基因由基因由RNA polymerase IIRNA polymerase II转录。转录。19ppt课件1.miRNA基因在染色体上的分布基因在染色体上的分布Molecular Cell 16(6),2004 20ppt课件Nat.Rev.Genet.5(7):522-31,2004.2.miRNAs的发生和作用机制模型21ppt课件2.miRNAs的发生和作用机制模型(1)核内由核内由RNA polymerase RNA polymerase IIII转录转录pri-miRNAspri-miRN
19、As，由由DroshaDrosha加工为加工为 pre-miRNAspre-miRNAs；(2)pre-miRNAspre-miRNAs由由Exportin-5Exportin-5在在Ran-GTPRan-GTP存在下转运出核；存在下转运出核；(3)细胞质中由细胞质中由DicerDicer剪切加剪切加工工,后解链成熟为后解链成熟为 miRNAsmiRNAs；(4)miRNAsmiRNAs与多种蛋白结合，与多种蛋白结合，形成形成RNARNA介导的沉默复合体介导的沉默复合体(RISC)RISC)，作用于靶基，作用于靶基mRNAmRNA的的3UTR3UTR，如果，如果miRNAmiRNA与与3UTR
20、3UTR存在完全互补，则导致存在完全互补，则导致mRNAmRNA切断切断降解，如果互补程度不降解，如果互补程度不高高,则引起靶则引起靶mRNAmRNA翻译抑制翻译抑制。Nat.Rev.Genet.5(7):522-31,2004.22ppt课件23ppt课件Cell 118(1),2004 3.RNase III的作用特点PLoS Biology 3(7),2005 24ppt课件 第一种以线虫第一种以线虫lin-4lin-4为代表，作用时与靶基因为代表，作用时与靶基因不完全互补结合不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响进而阻遏翻译而不影响mRNAmRNA的稳定性，这种的稳定性，这种miRNAm
21、iRNA是目前发现是目前发现最多的种类。最多的种类。第二种以拟南芥第二种以拟南芥miR-171miR-171为代表，作用时与靶标基因为代表，作用时与靶标基因完全互补完全互补结合结合，作用方式和功能与，作用方式和功能与siRNAsiRNA非常类似，最后切割靶非常类似，最后切割靶mRNAmRNA，这说明某些这说明某些miRNAmiRNA和和siRNAsiRNA一样参与了机体内一些特异性一样参与了机体内一些特异性mRNAmRNA的剪切过程。的剪切过程。第三种以第三种以let-7let-7为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶基为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶基因完全互补结合时，直接靶向切割因完
22、全互补结合时，直接靶向切割mRNAmRNA，如果蝇和，如果蝇和HelaHela细胞细胞中中let-7let-7直接介导直接介导RISCRISC分裂切割靶分裂切割靶mRNAmRNA；当与靶标基因不完全；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7let-7与靶与靶mRNA3mRNA3 端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。第四种作用时与靶基因第四种作用时与靶基因33非翻译区结合，进而影响非翻译区结合，进而影响mRNAmRNA的稳的稳定性。定性。4.miRNA对靶基因的
23、作用模式25ppt课件(III)miRNA 的功能 随着越来越多miRNA的发现，除了lin-4和let-7在线虫的发育过程中的时序控制作用外，人们发现其它生物的多种多样的生物学现象和生理过程与之息息相关。特别是在胚胎发育、细胞分化，以及肿瘤发生方面尤为突出。26ppt课件Nature 426(6968):845-849,2003.Nature 430(7001):785-789,2004.1.miRNAs在线虫嗅觉神经细胞分化过程中的作用线虫嗅觉感受器线虫嗅觉感受器(ASE)(ASE)功能上都是不对称的，左侧和右侧分别感受不同的化学信号。功能上都是不对称的，左侧和右侧分别感受不同的化学信号。
24、功能的不对称是由于功能的不对称是由于gcy-7gcy-7只在左侧表达，只在左侧表达，而而gcy-5gcy-5只在右侧的表达只在右侧的表达.(gcy:guanylyl(gcy:guanylyl 环化酶受体环化酶受体)gcy)gcy不对称表达是由不对称表达是由mir-273mir-273，lsy-6lsy-6的不对称表达决定的不对称表达决定27ppt课件Cell 121(7):1097-1108,2005.反义抑制miR-9细胞不能分裂,表皮不能形成。反义抑制miR-6的果蝇胚胎大量细胞凋亡(抗caspase-3的抗体染色)miR-9 antisensemiR-9 antisenseWTWT28p
25、pt课件miR-1Hand2 proteinHand2 mRNAProliferation/growthtimeNature 436(7048):214-220,2005.2.miRNAs在小鼠心脏发育中的作用miR-1在心脏形态建成中的作用示意图发育晚期的小鼠心脏剖面图示过表达miR-1抑制正常的细胞增殖，使心肌壁薄而松29ppt课件Neuron 46(3):363-367,2005.3.1 miRNAs在胚胎干细胞发育分化中的作用模式图proliferation stem cell maintenancedifferentiationcell-type specificmiRNA在特异的时
26、间表达，通过关闭特异蛋白质基因的表达，促进胚胎发育过程中一些事件的适时启动或关闭，保证正常的发育的进行。30ppt课件3.2 miRNA调控造血干细胞的分化3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程miR142S miR223 Science 303(5654):83-86,2004.31ppt课件Northern杂交确定了miR-375在INS-1细胞的表达 miR-375在部分糖尿病模型NOD小鼠的异常高表达（阳性率60%）反义反义2-O-甲基化寡核苷酸技术，特异性抑制甲基化寡核苷酸技术，特异性抑制 miR-375 不同浓度葡萄糖刺激经不同浓度葡萄糖刺激经2-O-me-eGFP(37
27、5)处理后处理后INS-1细胞胰岛素的分泌细胞胰岛素的分泌 实验基础实验基础 Mtpn在 INS-1细胞、正常小鼠和NOD小鼠的差异表达32ppt课件4.miRNA基因异常与肿瘤发生相关人类人类5252的的miRNAsmiRNAs定位在染色体的脆性位点定位在染色体的脆性位点(FRAs(FRAs)61个miRs和FRAs定位在同一染色体带(红色星表示),红色箭头表示癌症病例中观察到的频率较高的FRAs.PNAS 101(9):2999-3004,2004.人核型图显示113个FRAs和186 miRs的位置关系33ppt课件某些定位在染色体的脆性位点(FRAs)的miRNAs与肿瘤的发生有关PN
28、AS 101(9):2999-3004,2004.34ppt课件Nature 435(7043):834-838,2005.microarray显示肿瘤和正常组织中129种miRNA的表达水平 众多肿瘤miRNA整体表达水平下降35ppt课件let-7与肺癌的关系正常肺组织中正常肺组织中let-7let-7非常丰富；但肺癌中非常丰富；但肺癌中let-7let-7表达水平普遍下降表达水平普遍下降人人RASRAS是是let-7let-7的靶基因。体外证实的靶基因。体外证实let-7let-7抑制肺癌细胞系的增殖。抑制肺癌细胞系的增殖。肺癌组织中肺癌组织中let-7let-7表达不足，表达不足，RA
29、SRAS过度表达，癌细胞增殖迅速过度表达，癌细胞增殖迅速.Cell 120(5):635-647,2005.N.Engl.J.Med.352(23):2446-2448,2005.36ppt课件Nature 435(7043):828-833,2005.淋巴癌中miR-17-92簇的表达水平转miR-17-92簇小鼠迅速诱发全身癌变，小鼠死亡加快normalmiR-17-92簇可能是一种新的癌基因37ppt课件Nature Med 11(7):713-714,2005.a：miRNA过度表达，抑制了抑癌基因的正常表达；b：miRNA表达过少或缺失，不能有效抑制癌基因。abmicroRNAs通过
30、对抑癌基因和/或癌基因的调控与肿瘤的发生相关 38ppt课件动物中miRNA的功能miRNA靶基因功能品种lin-4lin-14线虫幼虫发育时间控制线虫 lin-28线虫幼虫发育时间控制线虫Let-7lin-41线虫幼虫发育时间控制线虫 Lin-57/hbl-1线虫幼虫发育时间控制线虫Lsy-6cog-1控制左右神经对称性线虫 miR-273die-1控制左右神经对称性线虫Bantamhid通过刺激细胞分化和阻止凋亡，调控果蝇组织生长果蝇miR-14?影响果蝇脂肪代谢和阻止凋亡果蝇miR-181?控制小鼠造血作用小鼠miR-196aHOXB8剪切靶mRNA小鼠miR-375Mtpn调控胰岛素分
31、泌 人mir-143ERK5脂肪细胞；人39ppt课件(IV)miRNA的研究方法 miRNA的寻找技术 miRNA的检测技术 miRNA功能的研究技术40ppt课件1.miRNA基因的寻找基因的寻找 克隆构建克隆构建small RNAsmall RNA库，进行筛选库，进行筛选 电脑模拟进行同源性搜索电脑模拟进行同源性搜索41ppt课件MicroRNA基因确认的基本原则A.A.能够通过与特定大小的总能够通过与特定大小的总RNARNA样品杂交得到样品杂交得到22nt22nt的产物（即需要的产物（即需要NorthernNorthern杂交或引物延杂交或引物延伸反应验证表达）伸反应验证表达）B.B.
32、所得的序列是从特定大小的（所得的序列是从特定大小的（22nt22nt）的小分子）的小分子RNARNA库中克隆到的，并且必需与克隆的来库中克隆到的，并且必需与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配源物种的基因组序列完全匹配 C.C.经过前体的二级结构预测，有发夹状的二级结构，并且成熟的经过前体的二级结构预测，有发夹状的二级结构，并且成熟的miRNAmiRNA序列在发夹的一条臂序列在发夹的一条臂上上D.D.成熟的成熟的miRNAmiRNA序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性E.E.在在DicerDicer突变的系统中，前体的积累增多突变的系统中，前体的积累增
33、多 理想的：A+D+E 充分的：A+D 必要的：A+C or B+DRNA 9:277-279,200342ppt课件 克隆建库寻找新的miRNA基因43ppt课件44ppt课件克隆到的miRNAs经过杂交验证其表达 45ppt课件Science 299，2003 电脑进行同源性比对寻找新的miRNA基因46ppt课件2.miRNA的检测技术的检测技术 芯片技术芯片技术 MicroarrayMicroarray 原位杂交原位杂交 其它方法其它方法47ppt课件应用芯片技术高通量的检测不同样品中多种miRNA的表达量的差异NAR 33(2)，2005 48ppt课件NAR 33(2)，2005
34、49ppt课件Science 309(5732):310-311,2005.原位杂交技术可以方便的检测miRNA的时空表达的差异神经系统神经系统肝脏肝脏肌肉肌肉血管和心脏血管和心脏侧线和感官系统侧线和感官系统前肾前肾50ppt课件3.miRNA的功能的研究方法的功能的研究方法 高表达高表达miRNAmiRNA（转基因）（转基因）在体内抑制在体内抑制miRNAs的表达的表达51ppt课件PLoS BIOLOGY 2(4):E98,2004 通过对miRNA的合成及功能行使过程所必需的蛋白复合物进行抑制从而降低miRNA的表达在体内使miRNA的表达量下调2-O-甲基修饰的与let7互补的寡核苷酸
35、的导入可以使let7丧失功能，是由于这种带修饰的寡核苷酸的结合封闭了RISK复合体52ppt课件Nature 423,2003针对miRNA的前体的发夹结构设计siRNA降低miRNA的表达量53ppt课件Curr.Opin.Chem.Biol.7(4):516-523,2003.1.染色体重塑 2.DNA甲基化 3.转录 4.RNA 加工 5.RNA 稳定性 6.RNA 转运 7.RNA定位 8.翻译 9.蛋白质活性10.miRNA 稳定性miRNAs可能参与各种基因表达过程的调控54ppt课件(V)miRNA and SNPs55ppt课件Functional analysis of SN
36、PsPromoterIntronExon2Exon15UTR3UTRFunctions of different elements above:Functions of different elements above:Promoter:Transcription5UTR:Transcription and translationCoding region:Function and activity of enzymes;Translation efficiencyIntron:Alternative splicing 3UTR:mRNA Stability,mRNA location and
37、 translation 56ppt课件Association study of MDM2o 234 bladder cancer cases,253 controls.o 5 out of 18 tagSNPs are positive(PC(P=0.01).mRNA:5UTRCoding region3UTR57ppt课件microRNA target predictionomicroRNA prediction:Based on“seed sequence”Pic Tar（http:/pictar.bio.nyu.edu)Targetscan （http:/www.targetscan.
38、org)58ppt课件SNP TCPutative microRNAsHas-mir-25/32/92/323/367Targetscan （http:/www.targetscan.org)59ppt课件SNP modulate miR-25 binding on structure and stabilityPredicted by Mfold60ppt课件SNP modulate miR-32 binding on structure and stability61ppt课件oThere are also predicted microRNAs,which are not likely
39、to be real regulators.oTaking miR-92 for Example:Inadequate basepairing Low thermodynamic stability62ppt课件Luciferase Assay to Confirm Our PredictionsLuciferaseREV3L 3UTRPoly ALuciferaseREV3L 3UTRPoly ALuciferaseREV3L Poly AT AlleleC Allele3UTR 11bp Deletion of putative microRNA target12363ppt课件Bladd
40、er derived T24 cell:*p0.05*P0.000111bp Deletion:Deletion of putative microRNA targets 64ppt课件Similar results from two another lines H1299 and SPC-A1 11bp Deletion:Deletion of putative microRNA targets*p0.05*P0.00165ppt课件Results:o C allele exhibited higher expression due to higher mRNA stability or translation efficiency.o About 2-fold expression surge strongly suggested the existence of microRNA mediated interplay.LuciferaseREV3L 3UTRPoly A66ppt课件Thanks a lot!67ppt课件
