1、反胶团萃取技术的产生反胶团萃取技术的产生 传统的分离方法，如液传统的分离方法，如液-液萃取技术很液萃取技术很难应用于对生化产品（如蛋白质、氨基酸难应用于对生化产品（如蛋白质、氨基酸、抗生素等）的提取与分离，原因在于这、抗生素等）的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活；而盐有机溶剂接触后会引起变性和失活；而盐析、沉淀、层析、电泳等生化分离方法又析、沉淀、层析、电泳等生化分离方法又不能实现连续和放大操作。不能实现连续和放大操作。因此，针对这两大难题，在因此，针对这两大难题，在2020世纪世纪7070年年代中期代
2、中期反胶团萃取技术反胶团萃取技术就发展起来了。就发展起来了。一、概述一、概述 反胶团是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。2.2 常用的表面活性剂常用的表面活性剂 可在非极性溶剂中形成反胶团。在用反胶团萃取技术分离蛋白质的研究中使用得最多的是阴离子型表面活性剂AOT(Aerosol OT)，其化学名称是丁二酸二异辛酯磺酸钠。n丁二酸二异辛酯磺酸钠丁二酸二异辛酯磺酸钠 这种表面恬性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小，形成反胶团时不需加入助表面活性剂，并且形成的
3、反胶团较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。n溶剂溶剂 通常为异辛烷(2，2，4-三甲基戊烷)AOT能溶解于有机溶剂中，也能溶解于水中，并形成反相微胶团。AOT在形成反胶团时的Wo值较大，可达170。因此在反相微胶团内就可以溶解较多的生物大分子而提高了萃取效率。2.3 反胶团的两个特异性功能反胶团的两个特异性功能 (1)具有分子识别并允许选择性透过的具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能半透膜的功能;(2)在疏水性环境中具有使亲水性大在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。分子如蛋白质等保持活性的功能。2.4 反胶团的形状和大小反胶团的形状和大小 反胶团的形状多
4、为球形或近似球形，有时也呈柱状结构，其半径一般为10100nm。胶团的大小取决于盐的种类和浓度、溶剂和表面活性剂的种类和浓度以及温度等。2.5 Wo值值 表征胶团大小较好的参数是Wo水与表面活性剂的摩尔比。用非极性溶剂中的水浓度和表面活性剂浓度之比来表示:Wo=H20/表面活性剂 nWo值的物理意义值的物理意义 Wo值越大，反相微胶团内的水分含量就越多，形成的反相微胶团的半径就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此，Wo值大小可以反映出反相微胶团的大小和溶解能力。n2.6 CMC 表面活性剂的临界浓度：表面活性剂的临界浓度：表面活性剂要形成反相微胶团，在溶剂中的浓度必须达到一定值，否则就不能形
5、成微胶团，这个形成微胶团所必需的最低浓度值，叫做表面活性剂形成微胶团的临界浓度(CMC)。不同的表面活性剂的CMC值在0.l-1.0mmol/L之间，随温度、压力和溶剂的变化而变化。2.7 水池的性质水池的性质 表面活性剂分子的聚集使反胶团内形成极性核，反胶团内溶解的水通常称为微水相或“水池”。由于反胶团内存在“水池”，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供适宜存在的亲水微环境。因此，“水池”的物理化学性质直接影响到反胶团萃取的适用范围和效率。当反胶团的含水率较低时，反胶团“水池”内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，以AOT为表面活性剂，当wo小于68时，反胶团内微水相的水分子
6、受表面活性剂亲水基团的强烈束缚，表观黏度上升50倍，疏水性也极高。随着wo的增大，这些现象逐渐减弱，当wo大于16时，微水相的水与正常的水接近，反胶团内可形成双电层。即使当wo值很大时，“水池”内水的理化性质也不可能与正常的水完全相同，特别是接近表面活性剂亲水头的区域内。反胶团内的水由于表面活性剂分子极性头电离具有很高的电荷浓度，因此“水池”中水的pH值不同于主体水的pH值。这一结论对于在反胶团内固定蛋白质的研究尤为重要。3 反胶团萃取蛋白质的过程反胶团萃取蛋白质的过程 蛋白质进入反胶团溶液是一种协同过程，即在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着
7、在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶团，此反胶团扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件(如pH值和离子种类及其强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃取过程生物大分子反胶团形成的方法生物大分子反胶团形成的方法 最常用到的有3种:（1）注入法（2）转移法 （3）溶解法（1）注入法 通过将含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性剂的有机相中，从而实现萃取过程。（2）相转移法 通过将含生物大分子的水相与溶解有表面活性剂的有机相接触，缓慢地搅拌，在形成反向微胶团的同时，其中的生物大分子即转入到反相微胶团中，直到处于萃取平衡状态为止。（3）溶解法 对于固体粉末中含有的生物大分子，
8、或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法进行。3.1 蛋白质溶入反胶团的推动力蛋白质溶入反胶团的推动力 蛋白质溶解于反胶团的主要推动力是表面活性剂与蛋白质的静电相互作用。此外，反胶团与蛋白质等生物分子间的空间相互作用对蛋白质的溶解率也有重要影响。3.1.1 静电作用力静电作用力 在反胶团萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互作用是萃取过程中的一种主要推动力。其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷，这与蛋白质等电点pI有关。即随着pH值的改变，被萃取蛋白质所带电荷的性质和带电量是不同的。对于阳离子表面活性剂形成的反胶团体系，萃取只发生在水溶
9、液的pHpI时，此时蛋白质与表面活性剂极性头问相互吸引；pHpI时，静电排斥力将抑制蛋白质的萃取。对于阴离子表面活性剂形成的反胶团体系，情况正好相反。3.1.2 空间位阻效应空间位阻效应 反胶团“水池”的物理性能(大小、形状等)及其中水的活度是可以用Wo的变化来调节的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。许多反胶团萃取的实验研究已经表明，随着Wo的降低，反胶团直径减小，空间位阻作用增大蛋白质的萃取率也减少。空间位阻效应也体现在蛋白质分子大小对分配系数的影响上。在各种蛋白质等电点处的反胶团萃取实验研究表明，随着蛋白质分于量的增大，蛋白质的分配系数(溶
10、解率)下降。当相对分子质量超过20000时，分配系数很小。该实验在蛋白质等电点处进行，排除了静电相互作用的影响，表明随分子量增加，空间位阻作用增大，蛋白质萃取率下降。因此，也可以根据分子量的差异利用反胶团萃取实现蛋白质选择性分离。3.2 影响反胶团萃取蛋白质的主要因素影响反胶团萃取蛋白质的主要因素 由上述分析可知，任何可以增加蛋白质与反胶团的静电作用或导致形成较大反胶团的因素，都有助于蛋白质的萃取。影响反胶团萃取蛋白质的主要因素，见表2-10。只要通过对这些因索进行系统的研究，确定最佳操作条件，就能得到合适的目标蛋白质萃取率。从而达到分离纯化的目的。(1)水相水相pH值的影响值的影响 水相的p
11、H值决定了蛋白质表面电荷的状态，从而对萃取过程造成影响。当蛋白质所带的电荷与反胶团内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质溶于反胶团中。(2)离子的种类和强度的影响离子的种类和强度的影响 与反胶团相接触的水溶液离子强度以几种不同方式影响着蛋白质的分配。离子强度增大后，反胶团内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶团内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度。反胶团内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶团变小，从而使蛋白质不能进入其中。离子强度增加时，增大了离子向反胶团内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，蛋白质从反胶团内再
12、被盐析出来。盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能盐的浓度越高，其影响就越大。阳离子的种类对萃取率的影响阳离子的种类对萃取率的影响 如Mg2+、Na+、Ca2+、K+对萃取率的影响主要体现在改变反胶团内表面的电荷密度上。通常反胶团中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上(相反离子缔合)。极性基团的电离程度愈大，反胶用内表面的电荷密度愈大，产生的反胶团也愈大。表面活性剂电离的程度与离子种类有关。同一离子强度下的四种离子对反胶团的Wo的影响见表2-11。由表2 11-可知，极性基团的电荷密度按K+、Ca2+、Na+、Mg2+的顺序逐渐增大，电离程度也相
13、应的增大。(3)表面活性剂的种类和浓度的影响表面活性剂的种类和浓度的影响 阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂都可用于形成反胶团，关键是应从反胶团萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷间的静电作用和增加反胶团大小的表面活性剂。除此以外，还应考虑形成反胶团及使反胶团变大(由于蛋白质的进入)所需的能量的大小以及反胶团内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生影响。增大表面活性剂的浓度可增加反胶团的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。因此，应选择蛋白质萃取率最大时的表面
14、活性剂浓度为最佳浓度。(4)溶剂体系的影响溶剂体系的影响 溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成和大小都有很大的影响，常用的溶剂有烷烃类(正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷、正十二烷等)、四氯化碳、氯仿等。有时也添加助溶剂，如醇类(正丁醇等)来调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。4 反胶团萃取的过程及工艺开发反胶团萃取的过程及工艺开发 4.1 反胶团萃取过程 水相中的溶质进入反胶团相需经历三步传质过程：通过表面液膜从水相到达相界面；在界面处溶质进入反胶团中；含有溶质的反胶团扩散进入有机相。反萃取操作中溶质亦经历相似的过程，只是方向相反，即在界面处溶质从反胶团内释放出来。4.2
15、 反胶团萃取工艺的开发反胶团萃取工艺的开发 采用连续操作模式，反胶团可以在两个萃取单元之间循环。反胶团萃取本质仍为液液有机溶剂萃取，无需特殊设备。典型的设备有混合澄清槽、膜萃取器、离心萃取器、微分萃取设备(如喷淋塔)等。(1)混台澄清槽萃取 混合-澄清式萃取器是一种常用的液液萃取设备，该设备由料液与萃取剂的混合器和用于两相分离的澄清器组成，可进行间歇或连续的液液萃取。但该设备虽大的缺点是反胶团相与水相相混合时，混合液易出现乳化现象，从而增加了相分离时间。5 反胶团萃取的应用反胶团萃取的应用 分子量相近的蛋白质，由于它们的pI及其他因素不同而具有不同的分配系数，可利用反胶团溶液进行选择性分离。思考题：思考题：反胶团萃取的基本原理和特点有哪些？解释利用反胶团萃取的基本原理分离核糖核酸酶、细胞色素C和溶菌酶的工艺过程。
