1、发光细菌法急性毒性的测定发光细菌法急性毒性的测定 四、实验材料与方法四、实验材料与方法 三、三、实验原理实验原理 二、二、实验目的与内容实验目的与内容 一、一、简简 介介主要内容主要内容 五、实验步骤五、实验步骤 六、注意事项六、注意事项 七、习题与思考七、习题与思考 1978年美国年美国 Beckman 公司即推出功能完备的公司即推出功能完备的生物发光生物发光光度计光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为Microtox测试。测试。简简 介介 发光
2、菌发光菌毒性测试是毒性测试是2020世纪世纪7070年代后兴起年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。性的新方法。采用现代光电检测手段采用现代光电检测手段(生物发光光度计生物发光光度计)的发光菌生物的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。该方法快速、该方法快速、简便、灵敏、廉价简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。1995 1995年年3
3、3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)(GB/T 15441-1995)。简简 介介实验目的与内容实验目的与内容一、实验目的一、实验目的1.1.掌握发光细菌毒性测试的标准方法；掌握发光细菌毒性测试的标准方法；2.2.根据发光细菌发光强度的变化判断根据发光细菌发光强度的变化判断 受试化合物的毒性；受试化合物的毒性；3.3.初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。二、实验内容二、实验内容1.1.发光细菌的复苏；发光细菌的复苏；2.
4、2.发光细菌发光强度的测定；发光细菌发光强度的测定；3.3.受试化合物毒性的计算。受试化合物毒性的计算。实验目的与内容实验目的与内容 发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。发光细菌的发光反应模式图发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可所示。发光细菌发光反应途径可简单概述为：简单概述为：FMNH2O
5、2RCHO荧光荧光FMNH2O+RCOOH （1）这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生化反应，反应的结果便产生光。化反应，反应的结果便产生光。发光菌的发光现象是其正常的代谢活动发光菌的发光现象是其正常的代谢活动,在一定条件下发在一定条件下发光强度是恒定的光强度是恒定的,与外来受试物与外来受试物(无机、有机毒物无机、有机毒物,抑菌、杀菌物抑菌、杀菌物等等)接触后接触后,其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓其发光强度
6、即有所改变。变化的大小与受试物的浓度呈相关关系度呈相关关系,同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光受试物通过下面两个途径抑制细菌发光:(1)直接抑制参与发光直接抑制参与发光反应的酶类活性反应的酶类活性;(2)抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如如细胞呼吸等细胞呼吸等)。毒物的毒性可以用毒物的毒性可以用EC50表示表示,即发光菌发光强度降低即发光菌发光强度降低50%时毒物的浓度。实验结果显示时毒物的浓度。实验结果显示,毒物浓度与菌体发光强度呈线毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因
7、而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小小,用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。实验原理实验原理NAD+FMNH2NADH FMNE2O2H2O2E1 FMNH2O2E1 FMN HOH呼吸产能E1 FMNH2 O2E1 FMNHOOHNADPH RCHONADP+RCOOHE3E1 FMNHOOH RCHO(Lump)E1E1 FMNH2 RCHORCHOO2hvRCOOHE1+FMN+H2O2图图(1)发光细菌的发光反应模式。发光细菌的发光反应模式。E1:细菌荧光素酶，由细菌荧光素酶，由、2个亚基
8、组个亚基组成，成，为为4000042000D，为为3700039000D。单独。单独、亚基均无发光活性，亚基均无发光活性，只有只有、共存时才有活性。共存时才有活性。E2:NADH：FMN氧化还原酶，分子量为氧化还原酶，分子量为3000D，对，对FMN有高度特异性。有高度特异性。E3:脂肪酸还原酶。脂肪酸还原酶。实验材料与方法实验材料与方法1.1.试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。氯化钠溶液，氯化钠溶液，2.0 g/100 ml(3.0 g/100 ml)，称取，称取2.0 g(3.0 g)氯化钠溶于氯化钠溶于100ml蒸馏水中，
9、置于蒸馏水中，置于2-5冰箱备用。冰箱备用。氯化汞母液，氯化汞母液，2 000 mg/L，万分之一分析天平精称密封保存，万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞良好的无结晶水氯化汞0.1000 g于于50 ml容量瓶中，用容量瓶中，用3.0 g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置于氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5冰箱备用，保存冰箱备用，保存期期6个月。个月。氯化汞工作液，氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液，用移液管吸取氯化汞母液10 ml入入1000 ml容量瓶，用容量瓶，用3.0 g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞管吸取氯化
10、汞20 mg/L 液液25 ml入入250 ml容量瓶，用容量瓶，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用然后，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L溶液按表溶液按表1稀释成系列浓度稀释成系列浓度(稀释至稀释至50 ml容量瓶中容量瓶中)。配制的稀释液保存。配制的稀释液保存期不超过期不超过24小时。小时。氯化氯化汞工汞工作液作液体积体积，ml0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0配制配制氯化氯化汞浓汞浓度，度，mg/L0.0
11、20.040.060.080.100.120.140.160.180.200.220.24表表1 氯化汞工作液稀释配制系列氯化汞工作液稀释配制系列(稀释至稀释至50 ml容量瓶中容量瓶中)2.明亮发光杆菌明亮发光杆菌T3小种小种(Photobacterium phosphoreum T3 spp.)冻干粉，安培瓶包装，在冻干粉，安培瓶包装，在2-5冰箱内有效保存期为冰箱内有效保存期为6个个月。新制备的发光细菌休眠细胞月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉冻干粉)密度不低于每克密度不低于每克800万个细胞；冻干粉复苏万个细胞；冻干粉复苏2 min 后即发光，可在暗室内检验，肉后即发光，可在暗室内检
12、验，肉眼可见微光，眼可见微光，稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于1.6万个细胞万个细胞(5毫升测试管毫升测试管)或或2万个细胞万个细胞(2毫升测试管毫升测试管)。在。在DXY-2型毒性测试仪上测出的初始发光量应在型毒性测试仪上测出的初始发光量应在600-1900 mV之之间，低于间，低于600 mV允许将倍率调至允许将倍率调至“X2”档，高于档，高于1900 mV允允许将倍率调至许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。发档。仍达不到标准者，更换冻干粉。发光细菌的毒性实验在美国光细菌的毒性实验在美国Maxwell（
13、MSI.）LuminMax-C 冷冷光仪完成。光仪完成。发光细菌的复苏发光细菌的复苏 从冰箱内取出含有从冰箱内取出含有0.5 g 发光细菌冻干粉和氯化钠溶液，置发光细菌冻干粉和氯化钠溶液，置于含有冰块的小号保温瓶，用于含有冰块的小号保温瓶，用1 ml注射器吸取注射器吸取0.5 ml冷的氯化冷的氯化钠钠2.0 g/100 ml溶液溶液(适用于适用于5ml的测试管的测试管)或或1 ml 冷的氯化钠冷的氯化钠2.5溶液溶液(适用于适用于2 ml的测试管的测试管)注入冻干粉中，充分混匀。注入冻干粉中，充分混匀。2 min后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉眼可见微光。备用。后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉
14、眼可见微光。备用。发光细菌的培养发光细菌的培养：(1)培养液：酵母浸出汁培养液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g，NaHPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油，甘油3.0g，加蒸馏水至，加蒸馏水至 1000ml,pH调至调至70.5，趁热分装于，趁热分装于150ml三角瓶中，每瓶约三角瓶中，每瓶约50ml，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经115、20-30min高高压蒸汽灭菌后置于压蒸汽灭菌后置于4左右冰箱中备用。左右冰箱中备用。(2)固体培养基：固体培养基：取上述培养液取上述培养液100ml，加入，加入1.52g琼脂粉，电
15、炉加热使溶解至琼脂粉，电炉加热使溶解至透明，调节透明，调节pH值为值为70.5，趁热用漏斗分装于试管中，每支试，趁热用漏斗分装于试管中，每支试管各约管各约10ml，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经121高压灭菌高压灭菌2030min后，取出制成斜面。后，取出制成斜面。(3)斜面菌种培养：斜面菌种培养：将发光菌冻干粉用将发光菌冻干粉用0.5ml 3%NaCl溶解，迅速转入溶解，迅速转入50ml培养液培养液中，中，20恒温培养，每恒温培养，每24h后转接一次斜面，将培养好的第三代后转接一次斜面，将培养好的第三代斜面置斜面置4冰箱中备用。冰箱中备用。(4)摇瓶菌液培养：将培
16、养好的第三代新鲜斜面菌种摇瓶菌液培养：将培养好的第三代新鲜斜面菌种T3接入装接入装 有有50ml培养液的培养液的150ml锥形瓶中，接种量不得超过一接种环，锥形瓶中，接种量不得超过一接种环，于于20振荡振荡(180r/min)培养培养12h(即对数生长期即对数生长期)后备用。后备用。(5)工作菌液培养：吸取一定量刚培养好的摇瓶菌液，用工作菌液培养：吸取一定量刚培养好的摇瓶菌液，用3%的的NaCl溶液稀释并磁力搅拌均匀。控制对照溶液稀释并磁力搅拌均匀。控制对照(2.0ml 3%NaCl溶液溶液+0.1ml工作菌液工作菌液)发光强度发光强度300mv-900mv。3.仪器：仪器：生物发光光度计，配
17、制生物发光光度计，配制2或或5 ml测试管，当氯化汞标准液浓度测试管，当氯化汞标准液浓度为为0.10 mg/L时，发光细菌的相对发光度为时，发光细菌的相对发光度为50，其误差不超过，其误差不超过10。2或或5 ml 测试样品管，具标准磨口塞，为制造比色管的玻测试样品管，具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造，分别适用于相应型号的生璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造，分别适用于相应型号的生物放光光度计。注射器物放光光度计。注射器(1 ml)、微量注射器、微量注射器(10 l)、定量加液瓶、定量加液瓶(5 ml)、吸管、吸管(2、10、25 ml)、试剂瓶、试剂瓶(100 ml)
18、、量桶、量桶(100、500 ml)、棕色容量瓶、棕色容量瓶(50、250、1000 ml)、半微量滴定管、半微量滴定管(配磨口试配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色，液瓶，全套仪器均为棕色，10 ml)等若干。等若干。在预实验的基础上，将待测物配成在预实验的基础上，将待测物配成5-7个浓度梯度，各个浓度梯度，各取不同浓度梯度溶液取不同浓度梯度溶液2ml加入具塞磨口比色管中，取加入具塞磨口比色管中，取0.2ml工作菌液与各比色管中，加塞上下振荡摇匀，去塞，暴露工作菌液与各比色管中，加塞上下振荡摇匀，去塞，暴露15min，以，以2ml3%的的NaCl溶液做空白对照。测发光强度。溶液做空白对照。测发光强
19、度。每个浓度梯度设每个浓度梯度设3组平行。组平行。测定测定 受试化合物的毒性作用用发光细菌的发光强度相对抑制率表示。受试化合物的毒性作用用发光细菌的发光强度相对抑制率表示。计算公式如下：计算公式如下：%100 对照发光强度样品发光强度对照发光强度相对抑制率 光强的相对抑制率与毒物毒性的大小成正比。通常用发光光强的相对抑制率与毒物毒性的大小成正比。通常用发光细菌光抑制细菌光抑制50的受试化合物浓度来表征其毒性效应的受试化合物浓度来表征其毒性效应(EC50)。将计算的光相对抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，将计算的光相对抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，根据所得回归方程可求出相应的根据所得
20、回归方程可求出相应的EC值。值。(2)实验结果实验结果注意事项注意事项（1 1）实验前判断发光细菌是否复合测试要求。）实验前判断发光细菌是否复合测试要求。（2 2）平行或批处理样品的处理与测试应注意）平行或批处理样品的处理与测试应注意 操作时间的一致性。操作时间的一致性。1.测试结果误差的主要来源？测试结果误差的主要来源？2.测试过程中，暴露时间、温度以及体系的测试过程中，暴露时间、温度以及体系的pH等等 对发光细菌的发光特性是否有影响，及影响如何？对发光细菌的发光特性是否有影响，及影响如何？3.本测试方法与上述三种测试方法的结果是否一本测试方法与上述三种测试方法的结果是否一致，应如何解释？致，应如何解释？思考与讨论思考与讨论
