1、 第七章第七章 放射免疫分析技术和免疫放射分放射免疫分析技术和免疫放射分析技术析技术 自从自从1959年年Yalow和和Berson创建放免以来，在创建放免以来，在方法学，以及相关技术都得到了大的发展：方法学，以及相关技术都得到了大的发展：一一.随着放射免疫分析的问世，其它的标记免疫分随着放射免疫分析的问世，其它的标记免疫分析方法相继衍生和发展，如竞争蛋白结合分析，析方法相继衍生和发展，如竞争蛋白结合分析，放射受体分析，酶联免疫吸附分析，时间分辨荧放射受体分析，酶联免疫吸附分析，时间分辨荧光免疫分析等。光免疫分析等。二二.传统的竞争性放射免疫分析逐步被非竞争性放传统的竞争性放射免疫分析逐步被非
2、竞争性放射免疫分析所取代。射免疫分析所取代。三三.相关技术得到了发展。由于单克窿抗体的出现相关技术得到了发展。由于单克窿抗体的出现和应用，是传统和应用，是传统RIA加速向非竞争性加速向非竞争性IRMA发展，发展，同时分离剂和自动化检测也有更大的发展。同时分离剂和自动化检测也有更大的发展。放射免疫分析技术（放射免疫分析技术（IRA）：）：其基本方法是放射性标记抗原和被测抗原（或标准品）对有限量的特异性结合剂（抗体）发生可逆性的竞争反应，最终形成放射性抗原抗体复合物与被测物的含量呈逆相关，因而是微量或超微量的待测抗原进行定量检测的一种方法。优点：灵敏度高，特异性强，应用范围广，操作简便。基本原理：
3、标记抗原和待测抗原（或标准品）对有限量的特异性抗体发生可逆的竞争结合反应，最终形成的放射性复合物与被测抗原含量呈负相关，所以也称为竞争性放射性免疫分析：Ag*+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab Ag 游离物(F)复合物(B)當Ab 含量為有限定量，則當Ag，Ag-Ab ，Ag*-Ab 免疫放射分析技术（免疫放射分析技术（IRMA）：）：主要原理是一种主要原理是一种标记抗体标记抗体与有限量的抗原与有限量的抗原结合，剩余的未结合的标记抗体再与固相结合，剩余的未结合的标记抗体再与固相抗原结合而被分离。抗原结合而被分离。Ag+Ab*Ag-Ab*+Ab*=Ag-Ab*+Ag-Ab*固相 當Ag ，則Ag-
4、Ab*，故復合物Ag-Ab*濃度與 Ag含量成正相關。Scatchard作图 Scatchard于1949年对化学反应进行数学推导，以几何图形的方法叙述了化学反应到达平衡时，游离物与结合物相互间的参数，称之为Scatchard作图法。抗原抗体反应是遵循质量作用定律的，因此其反应式和数学推导，可沿用Scatchard作图法进行推导。对IRA法：F B 式中，设Ag，Ab,AgAb分别是抗原、抗体、抗原抗体复合物（B），k1为结合常数，k2为解离常数，K为反应到达平衡时的亲和常数。Abt为抗体总浓度，F为游离物，B为结合物，B/F为两者比率，也称为竞争结合率。AgAbAgAbAbt=Ab+AgAb
5、Ab=Abt-AgAb12()()ttkAgAbBBKkAgAbFAbAgAbFAbB B/F对B作图，B为自变量，B/F为因变量，所得斜率为亲和常数K，x轴截距为Abt，y轴截距为KAbt，这就是Scatchard图。如图2.1。/()tB FKAbB/tB FK AbKB IRMA中抗原抗体反应，其本质与RIA一样，也服从质量作用定律，同样可从质量作用定律推导数学式，不同的是Ab表示标记Ab（即Ab*）。将上式展开*(*)(*)AgAbKAgAgAbAbAgAb21*(*)*0AgAbAgAbAgAbAgAbK*AgAbBAgp*Abq代入上式21(1)0qqBBpkpp AgAbAgAb
6、 在IRMA的反应体系中标记抗体是过量的，B值即为放射性活度，可直接用cpm数表示，为纵轴的单位，横轴与RIA一样是标准物的浓度，两者是正相关，而RIA却是负相关，这就体现了IRMA标准曲线剂量反应范围比RIA大，灵敏度也可明显提高。3、剂量反应曲线 Yalow以胰岛素为例，与抗体（两个结合1位点分别为Aba与Abb）相互作用，其反应曲线图2.2,aaAgAbAgAb bbAgAbAgAb将得到aabbB/F=k(Ab-B)+k(Ab-B)ababBBBAgAbAgAb在这种情况下，B/F对B作图是一条曲线 根据 t=kAb BF代入 A b=A b t-A g A b AgAb=Agt(B/
7、F)/(1+B/F)=kAbt-(AgtB/F/1+B/F)BF乘以得到剂量反应方程式1+B/FttB/F(1+B/F)-(1+B/F)kAb+B/FkAg=0 标准曲线：标准曲线可由B/F对Agt作图，即为在放免分析中常用的标准曲线。通过未知样品的B/F值，便可从曲线上读出对应x轴上抗原浓度。现工作中常用B/B0来表示，然后通过数学模式来进行数据处理，可直接打印出求知样品的测值。IRMA的测量反应曲线是根据下式来作图：ttt(B/F)2+B/F-kAb-B/FkAb+B/FkAg=0ttt(B/F)2+B/F(kAg-kAb+1)-kAb=021*(*)*0AgAbAgAbAgAbAgAbk
8、 式中，k和q是固定值，B随p增多而增大，二者呈双曲线关系，随着p的逐渐增大，q渐趋饱和，B渐近q，而曲线达到坪区，如图2.3。*AgAbBAgp*Abq代入上式 21()0BB pqpqk IRMA剂量反应曲线，随抗体量的增加，抗原量也需相应增加，标准线的斜率段也随之伸延，这就扩大了可测的剂量范围。一般RIA在剂量范围是二个数量级左右，IRMA可达到三个数量级以上。这时临床应用很有意义。例如TSH在甲亢症时，血中含量1U/ml，而TSH-IRMA的灵敏度达到0.02U/ml，所以TSH-IRMA就更适合应用诊断甲亢症。又如hCG，在血中含量低到3000U/ml以上，这样要求标准线的剂量范围很
9、大，才能适应临床。一般的RIA就要稀释标本来检测，而hCG-IRMA，其剂量范围为0.0055000U/ml，这就完全适合临床要求了。二、放射免疫分析方法学指标 1、灵敏度 所谓灵敏度，一般用最小检出量来表示，但也有用零剂量的精密度来表示的。实际上无论用哪种方法表示，某种物质的RIA，总得表示出最小检测量，才能达到临床应用的要求。在RIA中，标准曲线的斜率反映其灵敏度，即刚好能与被测物浓度为零时区分开来的量。而斜率与亲和常数K成正比。灵敏度的大小与K值有关，K值越大，灵敏度超高。IRMA的灵敏度同样决定于零剂量时的斜率，斜率同样和K成正比。IRMA的灵敏度要比RIA高。2、特异性 在RIA中，
10、特异性是指结合物与被测物的类似物交叉反应的程度。交叉反应越小，特异性越高。IRMA的特异性，由于IRMA是双位点夹心法，一种物质必须同时具备两个特异抗原决定簇与相对应的抗体反应，才能最后形成标记复合物。所以从理论上IRMA往往不易发生交叉反应，其特异性也就较高。但标记物是抗体，与类似抗原也存在交叉反应，仅是与RIA表现不同。在RIA中，类似抗原竞争结合抗体，使B值降低，而IRMA中表现的类似抗原与标记抗体结合，是使B值升高。3、精密度 无论RIA或IRMA，都是以精密度来衡量分析方法本身质量好坏的指标之一，亦称重复性。它是对分析方法的随机误差的描述，反映了用该分析方法对同一样品进行多次测定时，
11、测定值的标准差（s）和变异系数（CV）来表示。标准差表示各个测定值与均值的偏离程度，偏离度越大，表示均值的代表性越小。4、准确度 准确度是指测量值与真值符合的程度。RIA和IRMA也都是以准确度为指标，来衡量分析方法本身的质量。准确度和精密度是两个独立的统计学指标，因为有的分析尽管精密度很高，但准确度不一定好，但如准确度很好，则精密度必定也好。5、稳定性 有放射免疫分析中，稳定性是指不同的时期各批测定结果之间精密度的变异程度，可用批间变异系数表示。影响稳定性的因素主要是各种试剂在规定的存放条件下，非特异结合（NSB）、最大结合率（B0），回归系数，ED25，ED50，ED75值、质控血清测定值
12、与标准值的偏差等指标是否均在允许范围之内。IRMA的稳定性较好，当应用标记抗体的浓度远大于1/K时，K的影响就很小了。因为IRMA中标记抗体是过量的，无论温度、加样误差和非特异性均影响很小，所以IRMA的批内批间变异也都很小，这也是IRMA重要优点之一。6、有效性 RIA和IRMA都有一个临床应用有效性的问题，但往往强调方法学而忽视临床符合率。实际上无论哪种分析方法，都是为临床应用所制备的，如果失去这种意义，可以说该试剂盒一无用处。为此对厂家来说应该建立两个标准，一是试剂盒质量标准，二是临床符合率标准。免疫放射分析技术免疫放射分析技术 1986年Miles和Hales建立了免疫放射性分析法，由
13、于它应用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，待测物（或标准品）和放射标记抗体进行全量反应，故其灵敏度有明显的提高，可提高610倍。自单克隆抗体应用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展，近几年来又引入亲和素生物素系统的放大作用，使得免疫放射分析的灵敏度有明显的提高，国内外供应的超灵敏免疫放射试剂盒就是利用此原理制成的。免疫放射技术突出的优点是：抗体易于碘化标记，不改变抗原的免疫活性（因为抗原不标记），反应速率快（因为抗原抗体是全量反应），灵敏度高（测定从零的基准开始，且引入了生物素亲和素放大系统）工作范围宽，特异性高（因为应用单抗）、操作更简单（由于各种固相抗体的使用）。此法是利用标
14、记抗体来测定待测抗原，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析（immunoradiometric assay IRMA）,免疫放射分析的反应系统是非竞争性的全量反应，故亦称非竞争性免疫分析法。一、基本原理 放射性核素标记在抗体上，然后以过量的标记抗体与待测抗原结合，未结合的标记抗体通过和固相的抗原免疫吸附剂反应而除去，溶液中放射性与未知抗原浓度呈相关，这是经典的IRMA法，近年来发展有双位点IRMA以及在双位点IRMA基础上的标记第三抗体法，双标记抗体法和IRMABAS法等更为完善。IRMA法的基本数学模型同样遵循质量作用定律，其式如下：（b）2+1+KaLo-KaBo b-KaBo=0(一
15、)上式与竞争性分析的数学模型基本相同，是以b为函数的一元二次方程式，在直角坐标纸上，几何图形也是双曲线，b值随KaLo和Bo而变化，在一给定的IRMA中，Ka为一常数，而Bo为过量结合剂，Lo即待测抗原，b值随Lo值变化，b随Lo变，Lo越大，b也越大。（二）标记抗体浓度对剂量反应曲线的影响 从图121可知，亲和常数Ka相同的抗体，抗体含量越大，曲线欲达到饱和时需要更多的抗原，这说明曲线的可测范围越宽。但应指出，由于标记抗体量的增加，游离标记抗体也会增多，分离时将有明显的分离误差，使NSB升高，因此测量的灵敏度将下降，所以抗体最佳浓度应通过实验来选择。（三）亲和常数Ka与剂量反应曲线的关系 从
16、图122可见，Ka越小，相同量的抗体，其剂量反应曲线斜率越低，同时Ka值增加到一定程度，再提高Ka值对曲线斜率影响已很小，从图122可见，Ka小时，对过量抗体不易达到饱和，但可用的测定范围变宽，Ka较大时，曲线形状表现不对称。二、IRMA法分类 经典的IRMA法时待测抗原或标准品先与过量标记抗体反应形成标记抗体抗原复合物，未结合的标记抗体通过与固相抗原吸附剂反应除去，测定上清放射性。近年来，IR-MA法的发展极为迅速，由于它的突出优点（前述），越来越可能替代放射免疫分析法。根据其实验步骤，主要有以下几种类型。（一）双抗体夹心法 此法采用固相抗体来代替经典的固相抗原的IRMA法，固相抗体先与待测
17、物（或标准品结合），再与标记的另一抗体反应，形成固相抗体抗原标记抗体复合物，未结合的标记抗体留在溶液中被倾倒除去，测固相放射性如下式表示：上式中的Ab1、Ab2分别为抗一个抗原上的二个抗原决定簇的单抗，SP示固相。例如，美国Biotecx公司生产的ACTH IRMA试剂盒，其Ab1是单抗ACTH氨基端的抗体，Ab2是单抗ACTH羧基端的抗体；CA125试剂盒，固相涂布抗体是McAb B27.1，放射标记的抗体是McAb B43.13。SP-Ab1+AgSP-Ab1-Ag-*Ab2*Ab2（二）标记第三抗体法（标记双抗法）标记第三抗体法，此第三抗体即为抗夹心法中的那个标记抗体的抗体，亦即双抗，这
18、样设计是为了简化标记每一个特异性抗体，只要标记这个双抗体，即可作为通用示踪剂（125I标记兔抗老鼠IgG），如下式表示：SP-Ab1+Ag+Ab2SP-Ab1-Ag-Ab2-Ab3SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3*Ab3三）双标记抗体法 利用抗原有多个抗原决定簇，在单抗制备上可筛选出3个以上的特异性McAb，则其中一个可涂布固相上，其余两个均分别进行放射碘化标记，这样此复合物的比活度提高，有利于提高灵敏度和精密度，如下式表示：SP-Ab1+AgSP-Ab1-Ag+*Ab2*Ab3SP-Ab1-Ag*Ab2*Ab3（四）IRMA生物素亲和素的测定系统（biotio-avidin system
19、 IRMA:BAS-IRMA）1986年Willian D.Odell等首先在美国临床化学杂志发表生物素亲和素系统引入IRMA法测定促甲状腺素获得满意结果的报告，接着有Zahradnik等和peters等分别发表引用BASIRMA法检测ACTH，CEA等成功的报告。应用此法突出的特点是BAS具有放大的作用，使检测的灵敏度大大提高，目前一些超灵敏的IRMA试剂药盒就是应用此原理制成的.其基本原理如下：一个抗体IgG分子上，可以标记几十个生物素分子(一次放大)，因此凡有生物素衍生物的反应层就是一个放大级，亲和素由四个相同的亚基组成，中间经二硫建相连接，亲和素分子的每一个亚基都可以结合一个生物素分子
20、，故呈现四价反应性，从而又产生新的放大效应(二次放大)。生物素标记的IgG，在-20保存期2年不失活，本法的示踪剂是125I标记的链亲和素，可作为通用示踪剂，生物素和亲和素具有很高的亲和力，亲和常数Ka值达1015L/mol，较抗原抗体反应高10100万倍，且两者结合极为稳定，使测量的精密度也明显提高，如下式表示：SP-Ab1+AgSP-Ab1-AgAb2BBSP-Ab1-Ag-Ab2BB*ASP-Ab1-Ag-Ab2BB*A*A（五）BAS在IRMA法中作为分离剂 本法基本原理是：一个具有多位抗原决定簇的抗原，一方面与生物素化单抗结合，另外又与放射标记的另一个单抗结合，反应结合后，投入试管内一粒亲和素包被的聚苯乙烯珠（珠的直径约8mm），在170rpm震荡器室温震荡2h，弃上清，用含有TritonX-100PBS洗二次塑料珠，测塑料珠放射性，如下式表示：125I-Ab1+Ag+B-Ab2-125I-Ab1-Ag-Ab2-B-125I-Ab1-Ag-Ab2-B-A-SP BAS系统作为分离剂，其特点是克服了IRMA法多次离心洗涤的麻烦，其次由于亲和素与生物素结合更牢固，有可靠的稳定性。
