1、第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础 内切酶，即在核酸分子内部制造切内切酶，即在核酸分子内部制造切口的酶口的酶 形成形成5-P 和和3-OH末端末端2 2 性性 质质3 3 功功 能能 自我保护作用自我保护作用细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/M体系）体系）a a 限制（限制（RestrictionRestriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外限制性内切酶将侵入细菌体内的外源源DNADNA分子进行分解，切成小片段分子进行分解，切成小片段AABBBBBb b 修饰（修饰（ModificationModification）细菌自身的细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化碱基被
2、甲基化酶甲基化修饰保护，不能被自身的限制性内切酶修饰保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割识别切割 c c 限制修饰系统分子机理限制修饰系统分子机理 由三个连续基因位点所控制：由三个连续基因位点所控制：hsd R,hsdM,hsd S hsd R-限制性内切酶限制性内切酶:能识别能识别DNA分子分子上的特定位点并将双链上的特定位点并将双链DNA切断切断 hsd M-限制性甲基化酶限制性甲基化酶:催化催化DNA分子分子特定位点上的碱基甲基化反应特定位点上的碱基甲基化反应 hsd S-控制两个系统的表达控制两个系统的表达:协助上述协助上述两种酶识别特殊的作用位点两种酶识别特殊的作用位点 宿主细胞内
3、的甲基化酶将自身宿主细胞内的甲基化酶将自身DNADNA和噬菌和噬菌体体DNADNA实施特异性保护，封闭了自身限制实施特异性保护，封闭了自身限制性酶的识别位点性酶的识别位点 这种限制不完全，总有少数入侵这种限制不完全，总有少数入侵DNADNA会存会存活，得以在宿主细胞内复制，并被宿主活，得以在宿主细胞内复制，并被宿主的甲基化酶修饰，但同时，也丧失了原的甲基化酶修饰，但同时，也丧失了原宿主甲基化酶标记宿主甲基化酶标记d d 意义意义 寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，广泛存在于原核细菌中。有两方面程，广泛存在于原核细菌中。有两方面作用：作用：保护自身保护自身D
4、NA不受限制不受限制 破坏外源破坏外源DNA，使之迅速降解，使之迅速降解二二 限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 命名：命名：EcoR(E：属名；：属名；co：种名；：种名；R：酶：酶编码基因所在质粒；编码基因所在质粒；：发现次序：发现次序)三三 限制性内切酶类型限制性内切酶类型 目前鉴定出目前鉴定出3种不同的限制性内切酶种不同的限制性内切酶 I 型限制性内切酶型限制性内切酶 II型限制性内切酶型限制性内切酶 型限制性内切酶型限制性内切酶限制性内切酶的类型及其主要特性限制性内切酶的类型及其主要特性 II II型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 1970年，由年，由H.O.smi
5、th和和K.W.wilcox 从从流感嗜血菌中分离得到流感嗜血菌中分离得到 如如Hind II（1）识别位点）识别位点 未甲基化修饰的特异靶序列，多数呈中未甲基化修饰的特异靶序列，多数呈中心对称的回文结构，由心对称的回文结构，由4-8个碱基组成，个碱基组成，有些识别位点是连续的，有些则是间断的有些识别位点是连续的，有些则是间断的，如，如GANTCC C-A A-P Pu u-P Py y-T T-G GG G-T T-P Py y-P Pu u-A A-C C5 5 3 3 5 5 3 3（2）切割位点）切割位点EcoRGAATTCCTTAAG5 53 35 53 35 5G GC CT TT
6、 TA AA AA AA AT TT TC CG G3 33 35 5粘粘性性末末端端SmaCCCGGGGGGCCC5 53 33 35 55 5C CC CC CG GG GG GG GG GG GC CC CC C3 33 35 5平平头头末末端端绝大多数绝大多数IIII类酶在其识别位点内切割类酶在其识别位点内切割DNADNA 粘性末端粘性末端（cohensive end）连接便利连接便利 DNA 分子末端标记分子末端标记 平末端补齐平末端补齐一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)
7、和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans)，获，获19781978年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖 同裂酶同裂酶 (isoschizomers)(isoschizomers)：来源不同，来源不同，识别的是同样的核苷酸靶序列识别的是同样的核苷酸靶序列 同尾酶同尾酶(isocaudamer)(isocaudamer)：来源不同，识别的靶来源不同，识别的靶序列也各不相同序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端但都能产生相同的粘性末端由同尾酶所产生的由同尾酶所产生的DNADNA片段，是能够通过其粘性末端之间的片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验
8、中很有用处互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，称之为合形成的位点，称之为“杂种位点杂种位点”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构，。但这类杂种位点的结构，一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素 1 1、DNADNA的纯度的纯度 2 2、DNADNA的甲基化程度的甲基化程度 3 3、酶切反应的温度酶切反应的温度 4 4、DNADNA的分子结构的分子结构 5 5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液核酸限制性
9、内切酶的反应缓冲液DNA的纯度的纯度DNADNA的甲基化程度的甲基化程度 原核生物限制原核生物限制修饰体系，对识别序列中特定核苷酸修饰体系，对识别序列中特定核苷酸的甲基化，会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的的甲基化，会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌，在选用酶时应是失去甲基化酶的大肠杆菌，在选用酶时应注意注意：所选用的限制酶对甲基化的敏感性所选用的限制酶对甲基化的敏感性 依依DNADNA的不同来源选择不同的限制酶的不同来源选择不同的限制酶反应温度反应温度 大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度为为37 ，但也有许多例外，如，但也有许
10、多例外，如SmaI为为25 ，ApaI为为30 ，TaqI为为65 消化反应消化反应温度高于或低于温度高于或低于最适反应温度，最适反应温度，都会影响酶的活性都会影响酶的活性 每每ugDNA 用用1-5U酶切酶切1-2hDNA的分子结构的分子结构 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒或病毒DNA所需的所需的酶量比消化线性酶量比消化线性DNA高出高出20倍倍 一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有明显的差异，明显的差异，可能是由于可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异侧翼序列的核苷酸成分的差异造造成
11、的成的 有些特定的限制位点，只有当有些特定的限制位点，只有当其它的限制位点被广泛切割其它的限制位点被广泛切割时，时，才能被有关的核酸限制性内切酶消化才能被有关的核酸限制性内切酶消化 少数酶，如少数酶，如SacII对对不同部位的限制位点不同部位的限制位点的切割活性会有很的切割活性会有很大的差异，其中有些位点很难被切割大的差异，其中有些位点很难被切割 核酸限制性内切酶的缓冲液核酸限制性内切酶的缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液组分：核酸内切酶的标准缓冲液组分：MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巯基乙醇或、巯基乙醇或DTT以及以及BSA等等 NaCl或或Mg2浓度：降低酶的活性，导致识别浓
12、度：降低酶的活性，导致识别序列特异性改变序列特异性改变 Tris-HCl:稳定反应液的稳定反应液的pH在酶的最佳在酶的最佳pH范围范围内内 巯基试剂：保持酶的稳定性，避免失活巯基试剂：保持酶的稳定性，避免失活 Na、K离子：对部分酶反应敏感，部分酶则适离子：对部分酶反应敏感，部分酶则适应较广的离子强度的变化幅度应较广的离子强度的变化幅度酶解反应中的星号活性酶解反应中的星号活性 星号活性（星号活性（star activity）当酶反应体系发生改当酶反应体系发生改变时，酶的性能甚至酶切位点发生改变的现象变时，酶的性能甚至酶切位点发生改变的现象如如EcoRIEcoRI等等,在正常条件下，切割在正常条
13、件下，切割5GAATTC35GAATTC3，但在甘油浓度但在甘油浓度5%5%时时,也可切割也可切割5PnPnATPyPy35PnPnATPyPy3或者或者5AATT35AATT3限制性内切酶反应的终止限制性内切酶反应的终止 终止后直接电泳检测酶切结果终止后直接电泳检测酶切结果完全消化和部分消化完全消化和部分消化 完全消化完全消化 部分消化部分消化双酶切的方法双酶切的方法 先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割切割DNADNA，然后加入适量，然后加入适量NaClNaCl等金属离子等金属离子及第二及第二种酶，继续温育种酶，继续温育 使用适合于大多数限制酶的
14、单种缓冲液使用适合于大多数限制酶的单种缓冲液-谷谷氨酸钾缓冲液氨酸钾缓冲液(KGB)(KGB)，可使各种限制酶的活性达可使各种限制酶的活性达到较高到较高使用限制酶的注意事项使用限制酶的注意事项 第二节第二节 甲基化酶甲基化酶特征：与限制性内切酶相对应，识别位点相同特征：与限制性内切酶相对应，识别位点相同1.大肠杆菌中的甲基化酶大肠杆菌中的甲基化酶 （1）D a m（腺 嘌 呤 甲 基 化 酶）（腺 嘌 呤 甲 基 化 酶）:此 酶 可 在此 酶 可 在5GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有可使一些识别顺序中含有5GATC3的限
15、制性内切酶的限制性内切酶不能切割不能切割 如如BclI（TGATCA）（2）Dcm（胞嘧啶甲基化酶）（胞嘧啶甲基化酶）:此酶在序列此酶在序列5CCAGG3或或5CCTGG3中的胞嘧啶中的胞嘧啶C5上引入甲基，上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是受其影响的限制性内切酶是EcoRII 2.甲基化酶的用途甲基化酶的用途 就许多就许多II类限制性内切酶而言，都相应存在着相类限制性内切酶而言，都相应存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使其免受切割的第三位腺嘌呤上，从而使其免受切割 甲基化酶的用途是甲基化酶的用途是在必要时可以封闭某
16、一在必要时可以封闭某一限制性内切酶的酶切位点限制性内切酶的酶切位点,同时又可能产生同时又可能产生新的酶位点新的酶位点 如两个串联的如两个串联的TaqITaqI识别位点经识别位点经M MTaqITaqI甲基化封闭后，出现了一个依赖于甲基化的甲基化封闭后，出现了一个依赖于甲基化的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DpnIDpnI的切割位点的切割位点(下图下图)第三节第三节 连接酶连接酶 广泛存在于各种生物体内，其催化广泛存在于各种生物体内，其催化DNADNA双链上相双链上相邻的邻的3-OH3-OH和和5-P5-P共价结合形成共价结合形成3-53-5磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶：连接酶：大肠
17、杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA编码编码,NAD+,NAD+为能源辅为能源辅助因子助因子T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶:T4 T4 噬菌体噬菌体DNADNA编码编码,ATP,ATP为能源辅助因为能源辅助因子子,能进行平末端能进行平末端DNADNA片段的连接片段的连接连接温度：通常连接温度：通常3737，但这时粘末端之间的氢键不，但这时粘末端之间的氢键不稳定，所以温度应界于酶连接速率和末端结合速稳定，所以温度应界于酶连接速率和末端结合速率之间，一般认为率之间，一般认为4 41515较合适较合适 一一 DNA连接酶的发现连接酶的发现 19671967年，世界多个实验室发现年，世界多个实验
18、室发现催化催化DNADNA双链上相邻的双链上相邻的3-3-OHOH和和5-P5-P共价结合形成共价结合形成3-53-5磷酸二酯键磷酸二酯键的酶的酶 二二、特点、特点 2 连接条件连接条件 3 DNA连接酶连接反应条件连接酶连接反应条件 三、连接反应机理三、连接反应机理 四、连接反应温度四、连接反应温度 五、影响因素五、影响因素 六、反应体系六、反应体系 七七、连接操作、连接操作 八、体外连接八、体外连接DNA片段的几种方法片段的几种方法（1 1）直接直接用用T4DNAT4DNA连接酶连接连接酶连接（2 2）同聚物加尾同聚物加尾，先用末端核苷酸转移酶，先用末端核苷酸转移酶，给平末端给平末端DNA
19、DNA分子加上同聚物尾巴之后再分子加上同聚物尾巴之后再 用用DNADNA连接酶进行连接连接酶进行连接（3 3）衔接物衔接物用衔接物连接平末端用衔接物连接平末端DNADNA分子分子（4 4）DNADNA接头连接法接头连接法 平头末端平头末端（blunt end）在识别位点的对称轴上同时切割，如在识别位点的对称轴上同时切割，如EcoR 平头末端平头末端 特点特点 1 1、平末端和粘性末端连接方法、平末端和粘性末端连接方法2 2、同聚物加尾法、同聚物加尾法 3 3、衔接物法、衔接物法 衔接物衔接物(1inker)，化学方法合成的一化学方法合成的一段由段由10-12个核苷酸个核苷酸组成的、具有一个组成
20、的、具有一个或数个限制酶识别或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片位点的寡核苷酸片段段 4 4、DNADNA接头法接头法 第四节第四节 DNA聚合酶聚合酶 常用的常用的DNA聚合酶：聚合酶：大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶的聚合酶的Klenow大片段大片段T4DNA聚合酶聚合酶 T7DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 特点特点：脱氧核糖核苷酸连续加到双链：脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子分子引物链的引物链的3，-OH末端，催化核苷酸的聚合。其末端，催化核苷酸的聚合。其中，中，T7DNA聚合酶的聚合能力最强聚合酶的聚合能力最强1、DNA聚合酶聚合酶I反应条件反应
21、条件用途用途 DNA杂交探针的制备杂交探针的制备 缺口转移缺口转移(nick translation)(nick translation)2、Klenow 酶酶 用途用途3 3、T4 DNA T4 DNA 聚合酶聚合酶 T4 DNA T4 DNA 聚合酶用途聚合酶用途4、逆转录酶、逆转录酶Taq DNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度最适反应温度75，对对95高温具良好高温具良好稳定性，该酶不存在稳定性，该酶不存在35外切酶活性外切酶活性2.用途用途 DNA的体外扩增，经的体外扩增，经25次循环后才进次循环后才进入酶的反应稳定期，一个入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而分子因而可被扩增可被扩增4106倍倍 DNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反聚合酶链式反应应，包括以下三个步骤：，包括以下三个步骤：DNA模板变性模板变性(95)与与DNA引物退引物退火火(45)引物延伸引物延伸(72)Taq Pol 和和PCR 5 3 变性变性 3 5 5 3 引物引物 3 5 复性复性 5 3 5 3 3 5 引物引物 3 5 5 3 延伸延伸 5 3 3 5 3 5 第五节第五节 核酸修饰酶核酸修饰酶第六节第六节 单链单链DNADNA内切酶内切酶 基因突变基因突变
