1、肝病的病理形态特点及免疫组化染色体会（优选）肝病的病理形态特点及免疫组化染色体会2.石蜡切片石蜡切片 每张玻片上应放置超过每张玻片上应放置超过6个连续组织切片，有助于肝纤维个连续组织切片，有助于肝纤维化的病理诊断。化的病理诊断。3.3.染色染色 除常规染色供病理诊断用之外，根据条件除常规染色供病理诊断用之外，根据条件和需要作以下特殊染色和需要作以下特殊染色网状纤维染色，网状纤维染色，MassonMasson三色染色，三色染色，胶原纤维染色胶原纤维染色(Sirius red(Sirius red或免疫组化或免疫组化)Dm-HSC Dm-HSC-SMA-MFb -SMA-MFb Dm-SMAS1S
2、2S3S4各种病因引起肝纤维的病理学特点及分期各种病因引起肝纤维的病理学特点及分期1.1.慢性肝炎肝纤维化慢性肝炎肝纤维化 (Dr.Scheuer(Dr.Scheuer 方案）方案）活动性纤维间隔静止性纤维间隔活动性纤维间隔静止性纤维间隔 脂肪性肝病肝纤维化脂肪性肝病肝纤维化 穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液小叶中央区纤维化窦周纤维化小叶中央区纤维化窦周纤维化3.3.肝糖原累积病肝纤维肝糖原累积病肝纤维 4.Wilson病病 红氨酸(Rubeanic acid)染色,铜被染成深绿色5.血色病血色病 穿刺肝组织因含有大量含铁血穿刺肝组织因含有大量含铁血黄素
3、沉着呈火焰红色黄素沉着呈火焰红色肝细胞普鲁氏蓝染色阳性6.6.自身免疫性肝炎肝纤维化（自身免疫性肝炎肝纤维化（AIHAIH）门管区肝细胞呈花环状排列门管区肝细胞呈花环状排列Hepatic Rosette Hepatic Rosette，表现为数个水样变，表现为数个水样变性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环状结构。性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环状结构。7.7.原发性胆汁性肝硬化（原发性胆汁性肝硬化（PBCPBC）3 3期（间隔期）期（间隔期）90%90%出现自身抗体出现自身抗体(A-Mit)(A-Mit)，Florid duct lesion+Biliary PNFlo
4、rid duct lesion+Biliary PN，纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性4 4期（肝硬化）期（肝硬化）静止静止-纤维间隔内无炎症或轻度炎症纤维间隔内无炎症或轻度炎症 活动活动 Fibrous PN.Fibrous PN.8.8.血吸虫性肝纤维化血吸虫性肝纤维化 肝癌(LIVER CANCER)HCC ICC Combined hepatocellular and cholangiocarcinomaELPS(二步法)转移性腺癌74100%+HCC:011%+胆管型CK:CK19,CK7HCC阳性率1582%EnVision(Enhanced Label
5、led Polymer System,活动性纤维间隔静止性纤维间隔液氮法:将OCT包埋的组织块投入液氮数秒,等组织块冻结后,立即移入低温冰箱(装入封口塑料袋内密封)或放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片;速冻:目的是使温度很快下降迅速通过冰点,防止冰结晶产生。免疫组织化学染色的几点体会-SMA-MFb20世纪80年代（1981）许世民 ABC（亲和免疫组化）(2)最大限度地保存抗原性。防止冰结晶!RB200(四乙基罗达明B200)用570nm光激发,596 600nm滤片观察,呈橘红色ICC:10%+肝癌(LIVER CANCER)选择最合适的固定剂,如用福尔马林,必须用缓冲福尔马林4期（肝硬化）静
6、止-纤维间隔内无炎症或轻度炎症纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性肝癌病理诊断常用免疫组化和特染肝癌病理诊断常用免疫组化和特染 Hep Par1 线粒体相关抗原，与AFP无关 对胎儿和成人肝细胞高度特异 (HCC:阳性率8297%）AFP HCC阳性率1582%CD34:HCC型染色长条分枝，管壁纤细，管腔狭窄，分布均匀弥漫.而非癌肝组织内极少见.CK 18:HCC,ICC,Metastatic carcinoma:100%+上皮性肿瘤标志物 CK 19:胆管型CK:CK19,CK7 肝细胞 胆管上皮，ICC77100%ICC最好的标志物 CEA monoclonal CEA:毛细胆管 ICC，转移
7、性肝癌6075%+HCC:011%+polyclonal CEA:毛细胆管 HCC特异标志物之一 CK 20:胃肠道腺癌的主要标志物 转移性腺癌74100%+ICC:10%+HCC:0%+MOC31:抗人上皮相关抗原 转移性腺癌100%+ICC:92.9%+HCC:0%+胃癌肝转移 HBsAg:HCC:7080%+胞质型，胞核型阳性胞质型，核周型阳性 黏液染色AB/PAS 酸性黏多糖兰色（胆管腺瘤,ICC腔内黏液）中性黏多糖,糖原红色（假腺管型HCC)免疫组织化学染色的几点体会免疫组织化学染色的几点体会一、组织和细胞标本制备一、组织和细胞标本制备目的目的(1)最大限度地保存组织结构。最大限度地
8、保存组织结构。(2)最大限度地保存抗原性。最大限度地保存抗原性。注意事项在选择组织处理方法前，先根据实验目的，注意事项在选择组织处理方法前，先根据实验目的，参考抗体说明，确定组织处理方式参考抗体说明，确定组织处理方式(冰冻冰冻?石蜡石蜡?)。1.取材（1）原则尽可能新鲜，动物标本可选）原则尽可能新鲜，动物标本可选 用动脉灌注固定。用动脉灌注固定。（2）取材部位尽量包括病灶和正常组）取材部位尽量包括病灶和正常组 织交界处，避免选择坏死组织。织交界处，避免选择坏死组织。（3）避免挤压受挤压组织不但影响）避免挤压受挤压组织不但影响 HE切片的观察，还造成非特异性切片的观察，还造成非特异性 免疫组化组
9、织着色。免疫组化组织着色。2.固定 根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。容器要大容器要大,固定液要宽余固定液要宽余.固定时间既要考虑充分固定固定时间既要考虑充分固定,又不能太长又不能太长(依组织依组织块厚薄大小从块厚薄大小从24hr至至35天天,太长可溶性抗原会渗太长可溶性抗原会渗漏漏,阳性会减弱甚至转阴阳性会减弱甚至转阴.选择最合适的固定剂选择最合适的固定剂,如用福尔马林如用福尔马林,必须用缓冲必须用缓冲福尔马林福尔马林用于培养细胞效果较好,石蜡切片因常有自发荧光,
10、背景荧光较强,用时要注意EnVision(Enhanced Labelled Polymer System,4期（肝硬化）静止-纤维间隔内无炎症或轻度炎症转移性腺癌74100%+而非癌肝组织内极少见.直接免疫荧光法:干冰丙酮法:将200ml丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度可达70;将装有50ml异戊烷的小烧杯缓慢置入干冰丙酮饱和液中;然后将OCT包埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。自身免疫性肝炎肝纤维化（AIH）根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新鲜越好。（1）原则尽可能新鲜，动物标本可选注意事项在选择组织处理方法前，先根据实验目的，
11、参考抗体说明，确定组织处理方式(冰冻?石蜡?)。EnVision(Enhanced Labelled Polymer System,ICC:10%+常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。HCC阳性率1582%ICC:10%+免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用DAB以外的底物应注意有色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固物如明胶、甘油缓冲液等。胶原纤维染色(Sirius red或免疫组化)穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液3.制备蜡块 冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋温石蜡包埋,如无低温石蜡如无低温石蜡,可将组织块
12、尽可可将组织块尽可能修薄能修薄,以缩短脱水、透明、包埋时间以缩短脱水、透明、包埋时间,尽可尽可能保存组织内抗原稳定。能保存组织内抗原稳定。4.制备冰冻切片 冷冻包埋能较好保存抗原,新鲜及已固定材料均适合于冷冻包埋、切片。防止冰结晶防止冰结晶!预处理预处理:目的是减少组织中的水分以减少冰结晶的产生,方法是将已固定、冲洗的组织块放入2030%蔗糖缓冲液内,4冰箱过夜,再将组织块埋于OCT包埋剂 速冻速冻:目的是使温度很快下降迅速通过冰点,防止冰结晶产生。速冻方法液氮法液氮法:将将OCT包埋的组织块投入液氮数秒包埋的组织块投入液氮数秒,等组织等组织块冻结后块冻结后,立即移入低温冰箱立即移入低温冰箱(
13、装入封口塑料袋内装入封口塑料袋内密封密封)或放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片或放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片;干冰丙酮法干冰丙酮法:将将200ml丙酮注入小型广口保温瓶或保丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度温度可达可达70;将装有将装有50ml异戊烷的小烧杯缓慢置入异戊烷的小烧杯缓慢置入干冰丙酮饱和液中干冰丙酮饱和液中;然后将然后将OCT包埋的组织块投入包埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。异戊烷内速冻半分至一分钟。免疫组化染色后的衬染 常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果阳性信号在细
14、胞核阳性信号在细胞核,切勿衬染细胞核切勿衬染细胞核!细胞质衬染细胞质衬染:1%亮绿亮绿,但退色较快但退色较快,可改用坚可改用坚固绿固绿(FAST BLUE)染染,则保存时间较长则保存时间较长封固和保存封固和保存 绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用固，但如用DAB以外的底物应注意有以外的底物应注意有色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固物如明胶、甘油缓冲液等。封固物如明胶、甘油缓冲液等。酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。一一.常用
15、免疫组织化学方法常用免疫组织化学方法 免疫荧光免疫荧光:用于培养细胞效果较好用于培养细胞效果较好,石蜡切片因常有自发荧光石蜡切片因常有自发荧光,背景荧光较强背景荧光较强,用时要注用时要注意意 FITC(异硫氰酸荧光素)用450490 nm光激发,515nm 滤片观察,呈翠绿色 RB200(四乙基罗达明B200)用570nm光激发,596 600nm滤片观察,呈橘红色 TRITC(四甲基异硫氰酸罗达明)用530 560nm光激发,580nm滤片观察,呈红色 Texas red 用595nm光激发,615nm滤片观察,呈红色 直接免疫荧光法直接免疫荧光法:间接免疫荧光法间接免疫荧光法 双重荧光染色
16、双重荧光染色2.免疫组织化学免疫组织化学 常用方法:PAP ABC或LSAB ELPS(二步法)20世纪70年（1970）Sternberg Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP)20世纪80年代（1981）许世民 ABC（亲和免疫组化）Avidin-Biotin-Peroxidase Complex（3）避免挤压受挤压组织不但影响4期（肝硬化）静止-纤维间隔内无炎症或轻度炎症肝细胞普鲁氏蓝染色阳性肝细胞普鲁氏蓝染色阳性一、组织和细胞标本制备TRITC(四甲基异硫氰酸罗达明)用530 560nm光激发,580nm滤片观察,呈红色固定时间既要考虑充分固定,又不能太长(依
17、组织块厚薄大小从24hr至35天,太长可溶性抗原会渗漏,阳性会减弱甚至转阴.胶原纤维染色(Sirius red或免疫组化)织交界处，避免选择坏死组织。TRITC(四甲基异硫氰酸罗达明)用530 560nm光激发,580nm滤片观察,呈红色干冰丙酮法:将200ml丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度可达70;将装有50ml异戊烷的小烧杯缓慢置入干冰丙酮饱和液中;然后将OCT包埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。干冰丙酮法:将200ml丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度可达70;将装有50ml异戊烷的小烧杯缓慢置入干冰丙酮饱
18、和液中;然后将OCT包埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。活动性纤维间隔静止性纤维间隔干冰丙酮法:将200ml丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度可达70;将装有50ml异戊烷的小烧杯缓慢置入干冰丙酮饱和液中;然后将OCT包埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。(1)最大限度地保存组织结构。ICC最好的标志物对胎儿和成人肝细胞高度特异90年代中期：Enhanced Polymer One Step(EPOS)EnVision(Enhanced Labelled Polymer System,ELPS)简称二步法 1 mol 含 70 mol HRP+10 mol AB
