1、Outline 实时荧光定量实时荧光定量PCR基本原理基本原理 实时荧光定量实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理的实验设计和数据处理 实时荧光定量实时荧光定量PCR在临床和科研上的应用在临床和科研上的应用 实时荧光定量实时荧光定量PCR实验实例实验实例实时荧光定量实时荧光定量PCR基本原理基本原理常规常规vs实时实时 常规常规PCRPCR：借助电泳对扩增反应的：借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行半定进行半定量及量及定性定性分析分析 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术：利用技术：利用荧光信号的变化实时荧光信号的变化实时检测检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每
2、一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对最终精确的对起始模板起始模板的定量分析的定量分析MJ Research常规常规vs实时实时 优缺点比较优缺点比较 优势来自：优势来自：实验数据及定量分析方法实验数据及定量分析方法 荧光实时监测产物浓度荧光实时监测产物浓度实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分析每一次循环产物凝胶电泳分析终产物精确计算初始模板浓度，灵敏度高，检测单拷贝模板通过终产物定性分析模板浓度计算机自动纪录分析检测方法费时费力实验数据实验数据指数扩增期 实时荧光实时荧光PCR荧光曲线图荧光曲线图 循环数，荧光值循环数，荧光值 指数扩增期指数扩增期 数学规律数学规律非指数扩增期扩增产物荧光
3、曲线背景期PCR的数学知识的数学知识 理想的理想的PCRPCR反应：反应：Xn=X02n 非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：Xn=X0(1+Ex)n 方程式两边同时取对数得方程式两边同时取对数得:log Xn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得整理方程式得:log X0=(-log(1+Ex)n+log Xnn n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数X Xn n：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量X X0 0：初始模板量：初始模板量ExEx：扩增效率：扩增效率阈值与阈值与C(t)值值 阈值阈值(Xn)：荧光扩增曲线：荧光扩增曲线指数增长期指数增长期设定一设定一个个荧光
4、强度荧光强度标准（标准（PCR扩增产物量的标准）扩增产物量的标准）C(t)值值(n)：荧光信号（扩增产物）到达阈：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增值时所经过的扩增循环次数循环次数Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04PCR的数学知识的数学知识理想的理想的PCRPCR反应：反应：Xn=X02n非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：Xn=X0(1+Ex)n方程
5、式两边同时取对数得方程式两边同时取对数得:log Xn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得整理方程式得:log X0=(-log(1+Ex)n+log Xn 将将C(t)和达到和达到C(t)值时终产物的量值时终产物的量Xc(t)带入上式得：带入上式得：log X0=(-log(1+Ex)*C(t)+log Xc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系初始浓度的对数与循环数呈线性关系n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数X Xn n：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量X X0 0：初始模板量：初始模板量ExEx：扩增效率：扩增效率C(t)值的重现性值的重现性 相同模板在同一
6、台相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重仪上相同条件下重复复96次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性值具重现性荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量与初始模板含量 初始模板量越多，初始模板量越多，C(t)值越小值越小 C(t)与初始与初始模板浓度的对数值模板浓度的对数值成线性关系成线性关系定量原理定量原理 浓度的对数值浓度的对数值与与循环数循环数呈呈线性关系线性关系，根据样品，根据样品扩增达到域值的循环数扩
7、增达到域值的循环数就可计算出样品中所含就可计算出样品中所含的模板量的模板量荧光化学监测荧光化学监测 荧光化学物质反应产物浓度荧光化学物质反应产物浓度 荧光监测方法分类荧光监测方法分类 非特异性非特异性 SYBR Green I 特异性特异性 Molecular Beacon TaqManSYBR Green I 结合结合双链双链DNA分子小沟分子小沟 延伸结束，形成双链延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度发射出荧光，反映产物浓度 优点优点 使用方便，无需复杂的设计使用方便，无需复杂
8、的设计 无序列特异性，可用于不同模板无序列特异性，可用于不同模板 便宜，灵敏便宜，灵敏 缺点缺点 与与非特异性非特异性产物结合，干扰实验结果产物结合，干扰实验结果Molecular Beacon 颈环结构，与颈环结构，与特异产物特异产物配对配对 荧光素，淬灭剂荧光素，淬灭剂 FRET（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）优点优点 对目标序列有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 低背景低背景 缺点缺点 设计复杂设计复杂 只能用于一个特定目标只能用于一个特定目标 价格较高价格较高TaqMan 水解型水解型 荧光素，淬灭剂荧光素，淬灭剂 FRET（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）识别特异性
9、产物识别特异性产物 优点优点 对目标序列特异性高对目标序列特异性高 设计相对设计相对Molecular Beacon简单简单 缺点缺点 只适用于一个目标只适用于一个目标 价格较高价格较高 探针探针5端不能是端不能是G（切下后淬灭）（切下后淬灭）荧光化学监测方式总结荧光化学监测方式总结化学试剂化学试剂工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂信号检测信号检测主要应用范主要应用范围围SYBR Green I结合于双链结合于双链DNADNA的小沟中的小沟中否否延伸延伸熔解曲线分析熔解曲线分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因Molecular Beacon发夹型杂交探针发夹型杂交探针有有复性复性SNPS
10、NP分析分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因TaqMan水解型杂交探针水解型杂交探针（5-35-3外切）外切）有有任何步骤任何步骤SNPSNP分析分析定量和检测目标定量和检测目标基因基因小结小结 实时荧光定量实时荧光定量PCR 各种荧光监测方法的原理各种荧光监测方法的原理 实时荧光数据结果的初步分析实时荧光数据结果的初步分析 C(t)值值 线性关系线性关系实时荧光定量实时荧光定量PCR的实验设计的实验设计和数据处理和数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（度（DNA，RNA
11、）病毒病毒DNA或或RNA的拷贝数的拷贝数 转基因的拷贝数转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含量相对定量：计算初始反应模板的相对含量 差异表达分析差异表达分析 芯片评估芯片评估 转基因生物的检测转基因生物的检测 基因型检测基因型检测实时荧光实时荧光PCR绝对定量方法绝对定量方法 标准品，标准曲线标准品，标准曲线 已知浓度的相应已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释模板，按不同浓度稀释 根据实时根据实时PCR反应得到相应的反应得到相应的C(t)，构建标准曲线，构建标准曲线 样品样品 与标准品同时进行与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的反应得到未知浓度样品的C(t)值值un
12、known104103SYBR Green I 方法方法反应体系的建立反应体系的建立 按照常规按照常规PCR方法配制反应体系，并加入方法配制反应体系，并加入SYBR染料染料 程序程序 1.95c 5min 2.95c 20sec 3.60c 20sec 4.72c 20sec 5.Read Plate 6.Goto 2 repeat 39 7.72c 5min 8.4c forever 9.End问题：问题：PCR的不特异性产物；的不特异性产物；SYBR Green I的非特异结合的非特异结合解决：解决：熔链曲线分析，决定读板温度熔链曲线分析，决定读板温度Melting curve analy
13、sis熔链曲线分析熔链曲线分析 逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线荧光值的关系曲线温度温度荧光强度荧光强度Tm-dIdTTm熔链曲线分析熔链曲线分析 决定读板温度决定读板温度Non-specific productspecific productspecific product优化的程序优化的程序 1.95c 5min 2.95c 20sec 3.60c 20sec 4.72c 20sec 5.Read Plate 6.85c 1sec 7.Read Plate 8.Goto 2 repeat 39 9.72c 5min 10.Meltin
14、g curve analysis 11.End使用实时荧光定量使用实时荧光定量PCR进行绝对进行绝对定量的优势定量的优势 敏感性高敏感性高 检测低拷贝数样品：单拷贝检测低拷贝数样品：单拷贝 区分小差异样品：区分小差异样品：24，48，96，大范围拷贝数样品同时检测大范围拷贝数样品同时检测 100 1010 省时有效省时有效实时荧光相对定量实时荧光相对定量 相对定量的相对定量的目的目的 比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题相对定量的问题 解决样品材料不均一造成的差别解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别解决加样过程中的差别 内标基因内标基因 内标通常是内标通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小受环境因素影响较小 对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个内标对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个内标基因拷贝基因拷贝
