1、2020年10月2日1第一课件网网站 2020年10月2日2 第一节第一节 细胞因子检测概述细胞因子检测概述一、细胞因子的类型与作用特点二、细胞因子检测的特点与方法2020年10月2日3 由非神经内分泌细胞产生的一大类与免疫应答活动密切相关的低分子蛋白与多肽。细胞因子2020年10月2日4细胞因子的类型与作用特点细胞因子的类型与作用特点1、细胞因子的分类2、细胞因子的作用特点2020年10月2日5以生物学作用进行划分的分类以生物学作用进行划分的分类白细胞介素（Interleukin）IL-1、IL-2、IL-18干扰素（Interferon）IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumor
2、 necrosis factor）TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulating factor）M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforming growth factor）TGF-趋化因子（Chemokine）IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growth factor）EGF、FGF、IGF、PDGF2020年10月2日6TNFsILsIFNsTGFsChemokinesCSFs各类细胞因子间关系各类细胞因子间关系2020年10月2日71、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性2、多源与同源性3、高效性4、多效性（pleiotr
3、opy）5、丰余性（redundancy）6、协同性7、拮抗性8、网络性2020年10月2日8细胞因子细胞因子细胞因子受体细胞因子受体细胞因子的自分泌与旁分泌性细胞因子的自分泌与旁分泌性2020年10月2日9 I L-2 I FN-TNF-细胞因子的同源性与多源性细胞因子的同源性与多源性I FN-T细胞T细胞NK细胞2020年10月2日10IL-4Th细胞肥大细胞Th细胞B细胞细胞因子的多效性细胞因子的多效性2020年10月2日11Th细胞B细胞细胞因子的丰余性细胞因子的丰余性IL-2IL-4IL-52020年10月2日12Th细胞B细胞细胞因子的协同性细胞因子的协同性IL-4IL-52020
4、年10月2日13Th2细胞B细胞细胞因子的拮抗性细胞因子的拮抗性Th1细胞IL-4 I FN-2020年10月2日14细胞因子的网络性细胞因子的网络性IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、GM-CSFTNF TGF IL-1 IFNIL-1 IFNTNFIL-1 TGFIFNIL2 IL-4IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6TNF IFN IL-1 TGFTNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSFTNFTNF IL-1 TGFIL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IL-1 IL-6IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-G
5、SF IFN内皮细胞成纤维细胞TB2020年10月2日15细胞因子检测的特点与方法细胞因子检测的特点与方法1、检测的特点2、检测的方法 2020年10月2日16细胞因子检测的特点细胞因子检测的特点免疫原性较弱样品含量低样品具有时效性生物效应特异性差2020年10月2日17细胞因子检测的方法细胞因子检测的方法免疫学检测方法抗原性检测细胞生物学检测方法生物活性检测分子生物学检测方法基因表达检测2020年10月2日18 第二节第二节 细胞因子检测的方法与原理细胞因子检测的方法与原理一、细胞因子的细胞生物学检测二、细胞因子的免疫学检测三、细胞因子的分子生物学检测2020年10月2日19细胞因子的细胞生
6、物学检测细胞因子的细胞生物学检测1、检测方法与原理2、检测中的操作注意要点 2020年10月2日20检测方法与原理检测方法与原理细胞增殖或增殖抑制试验细胞病变抑制试验细胞毒试验细胞趋化试验2020年10月2日21滤膜：计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化试验原理示意趋化试验原理示意2020年10月2日22检测中的操作注意要点检测中的操作注意要点靶细胞的选择与培养检测标本的制备显示检测结果2020年10月2日23靶细胞的选择与培养靶细胞的选择与培养1、对所测的细胞因子有特异的敏感性2、易培养、保存、生物学特性稳定3、有良好的生长状态4、种属适配2020年10月2日24各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细
7、胞因子检测的常用靶细胞细胞因子 实验系统 干扰因素IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-42020年10月2日25各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞细胞因子 实验系统 干扰因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法
8、IL-8 中性粒细胞（M、H）趋化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）细胞毒法IFN wish（H）病变保护法 IFN-、IFN-L929（M）病变保护法 IFN-、IFN-第一课件网网站 2020年10月2日26检测标本的准备检测标本的准备1、分离特定的产生细胞2、对产生细胞进行诱导、激活3、选择适当的收集时间2020年10月2日27显示检测结果显示检测结果1、细胞增殖状态的显示：放射性核素掺入法、胞内酶活性显示法 活细胞染色法 细胞荧光测定法2、细胞毒或细胞病变状态的显示 活细胞染色法 胞内酶活性显示法 DNA断片测定法20
9、20年10月2日28直接计数法直接计数法 简便、直观简便、直观,但费时、主观因素影响大、但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化难以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法细胞代谢活性测定方法 3 3H-TdRH-TdR、125125I-UdRI-UdR掺入法或掺入法或MTTMTT等比色法等比色法细胞代谢产物测定法细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法面标记或可溶性分子测定法细胞增殖检测方法分类细胞增殖检测方法分类2020年10月2日29 通过检测细胞通过检测细胞DNADNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方合成的增加或减
10、少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，法。在细胞的增殖过程中，DNADNA合成的增加使得指示细胞对核合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3 3H/H/125125I I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。增殖的程度。结果客观易于自动化；结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染胞株影响；放射性污染(1)(1)放射性核素掺入法放射性核素掺入法2020年10月
11、2日30特点：不使用放射性核素，特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 测定步骤类似测定步骤类似与同位素掺入法相比与同位素掺入法相比掺入物：掺入物：MTTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同培养时间不同(2)MTT(2)MTT 比色法比色法2020年10月2日31敏感性较高敏感性较高特异性不高特异性不高操作繁琐操作繁琐易受干扰易受干扰生物学活性测定方法学评价生物学活性测定方法学评价2020年10月2日32细
12、胞因子的免疫学检测细胞因子的免疫学检测分泌型细胞因子的检测细胞内细胞因子的检测2020年10月2日33敏感性偏低敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。不能判断细胞因子的生物学活性。ELISAELISA特异、简便特异、简便易于推广和标准化等优点易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理理细胞因子测定的首选方法细胞因子测定的首选方法2020年10月2日34ELISPOT2020年10月2日35酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot)ElisaSpot)在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，在包被有
13、待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同续的反应如同ELISAELISA，即在洗去细胞后视用于试，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。法。一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子点的颜色深浅程度与细胞分泌的
14、细胞因子量相关量相关 基基本本原原理理2020年10月2日36细胞内细胞因子检测技术细胞内细胞因子检测技术激活膜抗原标记细胞内细胞因子标记2020年10月2日37流式细胞分析法流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同地进行单个
15、细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。1 1分离和培养待检细胞分离和培养待检细胞 2 2细胞固定细胞固定 3 3封闭非特异性结合位封闭非特异性结合位点点 4 4染色与分析染色与分析 基本步骤基本步骤2020年10月2日38使用流式细胞分析法，可以：使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1Th1细胞细胞 IFN-IFN-Th2 Th2细胞细胞 IL-4IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术单克隆抗体技术 直接或间接荧
16、光抗体染色直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态状态2020年10月2日39四、免疫学测定方法学评价四、免疫学测定方法学评价优点：优点：特异性高特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点：缺点：所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比一定呈正比 结果与所用
17、的抗体来源及亲和力有很大的关系结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合细胞因子的结合2020年10月2日40细胞因子的分子生物学检测细胞因子的分子生物学检测 此方法测定的并非细胞因子本身，而是细胞因此方法测定的并非细胞因子本身，而是细胞因子的基因。子的基因。方法：方法：1、Northern印迹杂交法印迹杂交法 2、Southern 印迹杂交法印迹杂交法 3、PCR与逆转录与逆转录PCR 4、原位杂交，原位、原位杂交，原位PCR和原位和原位RTPCR 2020
18、年10月2日41 第三节第三节 常用细胞因子的检测方法常用细胞因子的检测方法一、IL-2的检测二、IFN-的检测三、TNF的检测2020年10月2日42待检样品（细胞上清）指示细胞（CTLL-2）按不同稀释度加入37C，16-20小时加入3HTdR（1-5Ci）37C，4-6小时收集细胞测定白细胞介素白细胞介素-2-2的测定示意图的测定示意图2020年10月2日43待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同稀释度加入37C，4小时37C，24-48小时弃取上清，加入VSV观察细胞病变（镜检或比色）干扰素的测定示意图干扰素的测定示意图2020年10月2日44肿瘤坏死因子的测定示意图肿瘤坏死因
19、子的测定示意图待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同稀释度加入37C，24小时弃取上清，洗涤加入结晶紫染液，洗涤加入细胞裂解液，比色2020年10月2日45 第四节第四节 细胞因子受体的检测细胞因子受体的检测一、细胞因子受体的类型二、细胞因子受体的检测2020年10月2日46 细胞因子受体的类型细胞因子受体的类型膜型细胞因子受体分泌型细胞因子受体第一课件网网站 2020年10月2日47细胞因子受体的检测方法细胞因子受体的检测方法膜型细胞因子受体的检测 配体检测法 抗体检测法分泌型细胞因子受体的检测 标记抗体检测法48演讲完毕，谢谢观看！Thank you for reading!In order to facilitate learning and use,the content of this document can be modified,adjusted and printed at will after downloading.Welcome to download!汇报人：XXX 汇报日期：20XX年10月10日
