1、重组重组DNA技术技术刘新文北京大学医学部生物化学与分子生物学系刘新文，重组DNA技术第一节第一节 概述概述 DNA克隆克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复结合成一具有自我复制能力的制能力的DNA分子分子复制子，继而通过转化或转复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（克隆又称基因克隆（gene cloning）。）。基
2、因工程（基因工程（genetic engineering）：实现基因克）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技技术（术（recombinant DNA technology）刘新文，重组DNA技术一、一、克隆体系：目的基因、载体克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿工具酶、宿主细胞等主细胞等 1、目的基因目的基因（target gene）：cDNA或基因组或基因组DNA 2、载体载体(vector)：质粒质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等病毒和人工染色体等 cDNA （complementary DNA
3、）：指体外经反转录：指体外经反转录合成的，与合成的，与RNA（常指（常指mRNA）互补的单链）互补的单链DNA,单链单链cDNA进而合成双链进而合成双链cDNA。基因组基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组序列，称为基因组DNA。刘新文，重组DNA技术质粒质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环：存在于细菌染色体外的小型环状双链状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。细胞分裂时恒定地传给子代细胞。3.1 限制性核酸
4、内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):存在存在于细菌体内，能够识别和切割双链于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。苷酸序列的一类核酸酶。3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、酶、DNA酶，等酶，等 常用的是常用的是IIII类限制性内切酶类限制性内切酶 许多限制性核酸内切酶许多限制性核酸内切酶IIII的识别序列属于回文结构的识别序列属于回文结构刘新文，重组DNA技术配伍末端（配伍末端（c
5、ompatible end）：不同限制性内切酶产）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端生的相同粘性末端 3.2 DNA聚合酶：大肠杆菌聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（全酶）、（全酶）、Klenow片段片段(Klenow 酶酶)、T4 DNA聚合酶以及聚合酶以及Taq酶等酶等 3.3 DNA连接酶连接酶T4 连接酶：可用于粘端与平端的连接连接酶：可用于粘端与平端的连接 4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞 刘新文，重组DNA技术第二节第二节 DNA克隆的基本过程克隆的基本过程 分、切、接、转、筛、表达分、切、接、转、筛、表达一、一、“分分”：目的基因及
6、载体的制备：目的基因及载体的制备 1、分离基因的方法：化学合成、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、基因组文库、cDNA文库文库 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：）：在反应体系中加入模板在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特、特别设计的特异引物及耐热的异引物及耐热的DNA聚合酶（常用聚合酶（常用Taq酶），经多次酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合呈指数合成的过程成的过程 刘新文，重组DNA技术cDNA文库文库(cDNA library)：以：以mRNA为模板，
7、利用为模板，利用反转录酶合成与反转录酶合成与mRNA互补的互补的DNA，再复制成双链，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有体菌包含了所有cDNA信息，总称信息，总称cDNA文库文库。常用常用于筛选编码蛋白质的结构基因。于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)：利用限制：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组有基因
8、组DNA信息，总称基因组信息，总称基因组DNA文库文库 刘新文，重组DNA技术 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA 克隆载体（克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等扩增、序列分析和体外定点突变等 表达载体表达载体(expression vector)：用于在宿主细胞中表达：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物外源目的基因，获得大量表达产物 二、二、“切切”：限制性内切酶切割目的基因和载体：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA 三、三、“接接”：重组体的构建：重组体的构建
9、 四、四、“转转”：重组：重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 1、转化（、转化（transformation）：将质粒或其它外源）：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞(常用大肠杆菌常用大肠杆菌)，并使其获得新的，并使其获得新的表型的过程表型的过程 刘新文，重组DNA技术 2、转染（、转染（transfection）：将外源）：将外源DNA导入真核细胞导入真核细胞的过程的过程 3、感染（、感染（transfection）：以）：以l l噬菌体、柯斯质粒和噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬
10、菌体颗粒，才能感染适当的有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction）五、五、“筛筛”：筛选出含重组：筛选出含重组DNA的受体细胞的受体细胞 1、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂、分子杂交）】交）】2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法 刘新文，重组DNA技术六、六、“表达表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表：使克隆基因在宿主细
11、胞中复制、表达达 1、外源基因在原核细胞的表达、外源基因在原核细胞的表达 大肠杆菌是最常用的原核表达体系大肠杆菌是最常用的原核表达体系 真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体性的包涵体 2、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等 刘新文，重组DNA技术第三节第三节 重组重组DNA技术与分子医学的关系技术与分子医学的关系 疾病基因的发现、发展新药物、疾病基因的发现、发展新药物、DNA诊断、基因诊断、基因治疗及遗传病的防治治疗及遗传病的防治 一、疾病相关基因分析一、疾病相关基因分析 1、功能克隆
12、（、功能克隆（functional cloning）：根据基因的功能）：根据基因的功能（通常是根据其蛋白质）产物来寻找、克隆与疾病相（通常是根据其蛋白质）产物来寻找、克隆与疾病相关的基因关的基因 2、定位克隆（、定位克隆（positional cloning）：从一种致病基因）：从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因 二、制造生物活性蛋白二、制造生物活性蛋白 刘新文，重组DNA技术 三、基因诊断三、基因诊断基因诊断：利用分子生物学的基本原理和技术，在基因诊断：利用分子生物学的基本原理和技术，在DNA或或RNA水平上分析、鉴定与某些
13、疾病有关基因水平上分析、鉴定与某些疾病有关基因的改变（基因结构及其表达水平的异常）的改变（基因结构及其表达水平的异常）遗传病的产前诊断、感染性疾病的快速诊断、某些遗传病的产前诊断、感染性疾病的快速诊断、某些肿瘤的早期诊断以及器官移植供体的选择和法医学鉴肿瘤的早期诊断以及器官移植供体的选择和法医学鉴定等定等 四、基因治疗四、基因治疗 基因治疗（基因治疗（gene therapy）：）：将某种遗传物质转移将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，从而达到治疗到患者细胞内，使其在体内发挥作用，从而达到治疗疾病目的的方法疾病目的的方法 刘新文，重组DNA技术 1、基因治疗的方法、基因治疗的方
14、法（分类）（分类）（1）基因矫正（）基因矫正（gene correction）：）：将致病基因的异将致病基因的异常碱基进行纠正，而保留正常部分常碱基进行纠正，而保留正常部分（2）基因置换（）基因置换（gene replacement）：）：正常基因通过同正常基因通过同源重组，原位置换疾病基因源重组，原位置换疾病基因（3）基因增补（）基因增补（gene augmentation）：）：正常基因非定正常基因非定点整合，补偿疾病基因的功能或使原有功能加强点整合，补偿疾病基因的功能或使原有功能加强（4）基因失活（）基因失活（gene inactivation）：）：采用各种方式抑采用各种方式抑制或破坏
15、某种基因的表达，如反义制或破坏某种基因的表达，如反义RNA和和RNA干扰干扰(RNAi)技术、核酶与三链技术、核酶与三链DNA、基因敲除（基因敲除（gene knock-out）等等 刘新文，重组DNA技术概述概述刘新文，重组DNA技术质粒载体质粒载体 刘新文，重组DNA技术质粒载体质粒载体刘新文，重组DNA技术质粒载体质粒载体理想载体的条件：理想载体的条件：1、具有自主复制能力；、具有自主复制能力；2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体色体DNA分开；分开；3、分子量相对较小，能够容纳目的基因；、分子量相对较小，能够容纳目的基因；4、具有较多单一限制性
16、内切酶位点；、具有较多单一限制性内切酶位点；5、有一个或多个筛选标记；、有一个或多个筛选标记；6、具有较高的遗传稳定性。、具有较高的遗传稳定性。刘新文，重组DNA技术 质粒载体质粒载体1977年由Boliver等人自E.coli的天然质粒建成。1、克隆载体、克隆载体刘新文，重组DNA技术An example of an E.coli expression vector.质粒载体质粒载体2、表达载体、表达载体刘新文，重组DNA技术噬菌体载体噬菌体载体刘新文，重组DNA技术其它类型载体其它类型载体一、一、质粒（质粒（cosmid）二、逆转录病毒载体二、逆转录病毒载体三、三、Ti质粒质粒刘新文，重组
17、DNA技术其它类型载体其它类型载体四、酵母人工染色体（四、酵母人工染色体（YAC）刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术The interaction of EcoRI endo-nuclease with its target sequence.The dimeric enzyme(with its two subunits in gray and light blue)is shown bou
18、nd to DNA.In the top view the DNA binding site is facing the viewer.In the bottom view the bound DNA is facing away from the viewer and is not visible.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 刘新文，重组DNA技术工具酶工具酶 功功 能能 限制性内切酶限制性内切酶 识别特异序列、切割识别特异序列、切割DNADNA DNADNA连接酶连接酶 连接
19、连接DNADNA片段片段 DNADNA聚合酶聚合酶I I 合成合成DNADNA 反转录酶反转录酶 合成合成cDNAcDNA 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5 末端磷酸化末端磷酸化 末端转移酶末端转移酶 在在3 3 羟基末端进行多聚物加尾羟基末端进行多聚物加尾 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 刘新文，重组DNA技术基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤1、分、分2、切、切3、接、接5、筛、筛4、转、转6、表达、表达刘新文，重组DNA技术基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤刘新文，重组DNA技术基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤刘新文，重组DNA
20、技术基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤刘新文，重组DNA技术目的基因的获得目的基因的获得刘新文，重组DNA技术目的基因的获得目的基因的获得OH 3 OH 3 OH 3 Oligo dT primerDouble-strand cDNAOH 3 TTTnT 5 TTTnT 5 3 OHAAAnA5 Poly A tailmRNAReverse transcriptase dNTPsTTTnT 5 AAAnA5 OH 3 cDNAAlkali digestion of mRNA templatecDNADNA polymerase IdNTPsAAAnATTTnT 5 OH 3 AAAnATTT
21、nT 5 5 3 S1 nucleaseSingle-stranded hairpin susceptible to S1 nucleasemRNA三、三、cDNA文库的建立文库的建立刘新文，重组DNA技术目的基因的获得目的基因的获得四、DNA聚合酶链反应（PCR）刘新文，重组DNA技术重组体构建重组体构建一、一、刘新文，重组DNA技术DNA片段片段A DNA片段片段B 5 3 5 A G A T C T3 3 5 3 T C T A G A5 不同的限制性内切酶水解不同的限制性内切酶水解混合后经混合后经DNA连接酶连接连接酶连接BamHI BglII G A T C T A G A T C
22、TA 粘端粘端重组体构建重组体构建配伍末端连接配伍末端连接刘新文，重组DNA技术Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined.重组体构建重组体构建 The optimal substrate for terminal transferase is the 3 OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long.粘端的生成粘端的生成刘新文，重组DNA技术重组体构建重组体构建
23、刘新文，重组DNA技术重组体构建重组体构建刘新文，重组DNA技术重组体导入细胞重组体导入细胞刘新文，重组DNA技术重组子的筛选重组子的筛选刘新文，重组DNA技术重组子的筛选重组子的筛选刘新文，重组DNA技术重组子的筛选重组子的筛选刘新文，重组DNA技术重组子的筛选重组子的筛选刘新文，重组DNA技术重组子的筛选重组子的筛选Identifying a clone with the desired DNA segment 氨基酸序列氨基酸序列预测核苷酸序列预测核苷酸序列刘新文，重组DNA技术基因工程的应用基因工程的应用刘新文，重组DNA技术基因工程的应用基因工程的应用定点突变定点突变刘新文，重组DN
24、A技术基因工程产品基因工程产品刘新文，重组DNA技术A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is expressed.Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin,the substrate for this lightproducing enzyme(see Box 13-3,Fig.2).Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at your
25、local nursery anytime soon;the light is actually quite weak and this photograph represents a 24 hour exposure.The real point-that this technology allows the introduction of new traits into plants-is nevertheless elegantly made.转基因植物转基因植物刘新文，重组DNA技术基因工程的应用基因工程的应用转基因动物转基因动物刘新文，重组DNA技术 2、基本程序、基本程序（1）治疗
26、性基因的选择）治疗性基因的选择（2）载体的选择）载体的选择（3）靶细胞的选择）靶细胞的选择（4）基因转移）基因转移 直接体内疗法：将外源基因转移到体内特定细胞直接体内疗法：将外源基因转移到体内特定细胞内，使外源基因得到表达，从而达到治疗的目内，使外源基因得到表达，从而达到治疗的目 间接体内疗法（细胞介导）：将外源基因导入合间接体内疗法（细胞介导）：将外源基因导入合适的靶细胞内并使其表达，体外进行细胞增殖后再适的靶细胞内并使其表达，体外进行细胞增殖后再输回病人体内，使基因在体内表达以达到治疗的目输回病人体内，使基因在体内表达以达到治疗的目的的（5）外源基因表达的筛检）外源基因表达的筛检（6）回输体内）回输体内
