1、抗体工程蛋白质工程抗体工程蛋白质工程（优选）抗体工程蛋白（优选）抗体工程蛋白质工程质工程淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？利用B淋巴细胞产生抗体的功能。利用肿瘤细胞无限增殖的特性。利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养
2、体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体l如何获得融和细胞？l如何得到单个融和细胞？l如何筛选杂交瘤细胞？l鉴别是否分泌所需抗体?杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选(1)(1)l骨髓瘤细胞为骨髓瘤细胞为HGPRT基因缺陷型细胞，不能合成基因缺陷型细胞，不能合成DNA。需经应急途径合成。需经应急途径合成DNA。HAT培养基含有次培养基含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻断骨髓黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻断骨髓瘤细胞的应急瘤细胞的应急DNA合成。所以骨髓瘤细胞不能在合成。所以骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中生长存活培养基中生长存活.lB淋巴细胞具有淋巴细胞具有HG
3、PRT基因但不能在体外生长。基因但不能在体外生长。l利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含HAT的的培养基中生长的融合子。培养基中生长的融合子。HGPRT:次黄嘌呤核糖磷酸转移酶次黄嘌呤核糖磷酸转移酶 HAT：次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选(2)(2)整个制备过程为何要经过两次筛选整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞杂交瘤细胞第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产
4、生所需抗体的杂交瘤细胞。出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。思考：思考：1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体l鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培
5、养，收集上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水来制备相应的抽取腹水来制备相应的McAbMcAb，但生产规模，但生产规模和产量均受限制。和产量均受限制。单克隆抗体的优势1高特异性，针对一个抗原靶点。2高纯度，成份均一，来自一个克隆。3高效价，抗体的滴度高。4高效益，国际上近100亿美元市场。5易制备。6前景好，McAb 1995问世后，风糜全球，寄予厚望。单克隆抗体应用领域1 1McAbMcAb作为诊断试剂应用作为诊断试剂应用 这是目前应用最广的领域，目前已有许多成套这是目前应用最广的领域，目前已有许多成套的诊断试剂盒在诊断传染病，代谢病和免疫性疾的
6、诊断试剂盒在诊断传染病，代谢病和免疫性疾病中应用，取得良好经济和社会效益，全世界有病中应用，取得良好经济和社会效益，全世界有上百亿市场。举例早孕试纸，乙肝诊断试剂盒上百亿市场。举例早孕试纸，乙肝诊断试剂盒（-FcRI-Ricin A）从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水来制备相应的McAb，但生产规模和产量均受限制。直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。选择目的抗体 把含有抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈
7、现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。2噬菌体表达载体的构建蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。化学交联法基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，以体外
8、人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。核磁共振(NMR)光谱研究处在溶液状态的蛋白质的结构。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好。肿瘤的影像分布用于肿瘤的导向治疗化学合成EnkN端5肽编码区，通过连接5肽编码区与人1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。2 2抗体导向治疗抗体导向治疗 用特异性单抗为载体，将抗瘤药物、用特异性单抗为载体，将抗瘤药物、放射性核素以及毒素等毒性物质导向性携放射性核素以及毒素等毒性物
9、质导向性携带至肿瘤灶局部，可特异性杀伤肿瘤细胞，带至肿瘤灶局部，可特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞损伤较轻。将毒素与单抗连而对正常细胞损伤较轻。将毒素与单抗连接常称为免疫毒素。常用的毒素包括植物接常称为免疫毒素。常用的毒素包括植物毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和细菌毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和细菌毒素（如白喉外毒素、绿脓杆菌外毒素毒素（如白喉外毒素、绿脓杆菌外毒素等）。等）。3 3McAbMcAb作作免疫抑制剂免疫抑制剂应用，应用于器官移应用，应用于器官移植。植。当前当前McAbMcAb最具代表的是抗最具代表的是抗TNFTNF单抗治疗类单抗治疗类风湿和回肠炎有效，有风湿和回肠炎有效，有20
10、20亿美元市场。其亿美元市场。其他在抗肿瘤，抗排异及抗血栓方面也很看他在抗肿瘤，抗排异及抗血栓方面也很看好。好。l19801980年后，其开发走向下坡路，临床实验失败，年后，其开发走向下坡路，临床实验失败，股票狂跌，损失以百万美元计。股票狂跌，损失以百万美元计。l原因病人过敏及免疫性疾病加重病人病情，体内原因病人过敏及免疫性疾病加重病人病情，体内很快排异及对肾脏毒性。很快排异及对肾脏毒性。l但到但到20002000年又有回头，年又有回头，20012001年被认为在免疫学上年被认为在免疫学上是是“单克隆抗体年单克隆抗体年”，抗体研究将迅速发展，现，抗体研究将迅速发展，现单在治疗方面就有单在治疗方
11、面就有1010种单抗进入市场，种单抗进入市场，3 3种待批上种待批上市，近市，近100100种在进行临床试验阶段。当然，与种在进行临床试验阶段。当然，与McAbMcAb技术改进关系极大。技术改进关系极大。资料资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内克隆抗体做体内诊
12、断，借以鉴别和定位体内“病灶病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。肌梗塞的诊断。问问 题题异源蛋白导致产生抗抗体，异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果影响靶向性和效果在体内被清除速度快在体内被清除速度快靶部位摄取的量太低靶部位摄取的量太低效应功能弱效应功能弱产业化产业化 对对 策策 抗体人源化抗体人源化 抗体人源化抗体人源化 改变抗体分子大小改变抗体分子大小 连接毒素、放射性连接毒素、放射性同位素、药物同位素、药物 体外表达抗体体外表达抗体抗体治疗存在的问题及对策抗体治疗存在的问题及对策基因工程抗体基因工程抗体 通过基因
13、重组改良抗体性能通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体免疫球蛋白分子的基本结构免疫球蛋白分子的基本结构第二节第二节 鼠单抗人源化鼠单抗人源化Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共转染细胞共转染细胞启动子启动子人人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠鼠VH鼠鼠V L人人CL人人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人-鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工程抗体 定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋白操作时更
14、应注意。3端引物常选J区保守序列。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。建立肽库（peptide library）。2噬菌体表达载体的构建4高效益，国际上近100亿美元市场。利用B淋巴细胞产生抗体的功能。连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。中改是对蛋白质分子中某些结构单元或肽段进行分子裁剪，通过基因操作，在不同的蛋白质分子之间替
15、换结构单元，以期得到新的功能组合。比如TNFa抗体 与 TNFRFc可变区人源化人改型抗体将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA 则位于病毒粒子内。（优选）抗体工程蛋白质工程玉米中赖氨酸含量可提高数倍Met/Ala(222),成功地制备出具有耐碱、耐热以及抗氧化的各种新特性的蛋白酶。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。3抗肿瘤肿瘤和其他疾病的导向治疗和资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。CDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克
16、隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体人源化抗体鼠单克隆鼠单克隆V区人源化（区人源化（CDR移植）移植）32已批准上市的单抗已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥大肠癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎症性肠病、类风湿CD317-1A血小板受体baCD20CD25TNF-OKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠单抗鼠单抗人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体19861995(德国)1994199719981998、199933适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSV F
17、蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体化疗药物交联物人源化抗体19971998199820002001第三节第三节 小分子抗体小分子抗体用基因工程方法，用基因工程方法，将抗体将抗体重链和轻链可重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成变区）通过一个连接肽连接而成Ag从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转
18、染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。蛋白质工程 (protein engineering）另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。5端引物选Ig前导肽保守序列，5 端引物也可选Ig分子骨架区1(FR1)的保守序列。直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的112，故也称之为小抗体。核磁共振(NMR)光谱研究处在溶液状态的蛋白质的结构。将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通
19、过一个连接肽连接而成的小分子抗体，（2）测定其氨基酸序列；将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA 则位于病毒粒子内。蛋白质工程 (protein engineering）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。螺旋，折叠区一般不会存在酶的活性中心及底物的结合中心，只是结构支架。可变区人源化人改型抗体如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成AgAg第四节第四节 抗体融合蛋白抗体融合蛋白l免疫毒素又称生物导弹，是由导向性的载体分子（抗体部分）与具有毒性的弹头
20、蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。免疫毒素免疫毒素CCVCVCC CSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Ricin A:Ricin A:蓖麻毒素蓖麻毒素A,A,对肿瘤细胞具有毒性作用对肿瘤细胞具有毒性作用CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2 免疫细胞因子免疫细胞因子(Immunocytokine)(Immunocytokine)偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质连接放射性同位素连接放射性同位素(131131I I、99m99mTcTc）连接植物或细菌毒素（连接植物或细菌毒素（ricinricin、PEPE4040）连接细胞毒性药物（连接细胞毒性药物（C1
21、027C1027、柔红霉素）柔红霉素）第五节第五节 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术(phage antibody library)一、噬菌体展示系统一、噬菌体展示系统将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的粒的表面，而编码该融合子的 DNA 则位于病毒粒子内。则位于病毒粒子内。Smith Smith 在在 1985 1985 年首次证实外源年首次证实外源 DNA DNA 可可以插入丝状噬菌体基因以插入丝状噬菌体基因 III III 中，并与中，并与 pIII pIII 蛋白融合展
22、示。蛋白融合展示。Smith GP.Science 1985;228:1315-7噬菌体展示技术噬菌体展示技术1Pan library withimmobilized targets2Wash off unbound phage3Elute bound phage4Amplify overnight5Pan eluted phage6Isolate individual colony3-4 2004 Montarop Yamabhai二、二、噬菌体抗体库噬菌体抗体库 运用运用DNADNA重组技术把人抗体基因与噬重组技术把人抗体基因与噬菌体载体菌体载体DNADNA相连，在噬菌体表面呈现并相连，在
23、噬菌体表面呈现并制备人类全套抗体的技术。制备人类全套抗体的技术。phage antibody library phage antibody bank 因此因此,噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 不经免疫不经免疫 不经细胞融合技术不经细胞融合技术 即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。（一）噬菌体抗体库技术基本方法（一）噬菌体抗体库技术基本方法 1 1抗体基因的扩增抗体基因的扩增:利用利用PCRPCR技术，从外周技术，从外周B B淋巴细胞淋巴细胞DNADNA中分别中分别扩增出轻链、重链可变区的基因。扩增出轻链、重链可变区的基因。也可从也可从B B细胞
24、细胞mRNAmRNA中，经逆转录为中，经逆转录为cDNAcDNA后再扩后再扩增。增。除除B B细胞外，外周淋巴细胞、脾、淋巴结细胞外，外周淋巴细胞、脾、淋巴结和骨髓细胞也可选用。和骨髓细胞也可选用。显而易见，此法除了引物设计十分重要外，显而易见，此法除了引物设计十分重要外，还要考虑机体免疫状态、细胞种类和数量、还要考虑机体免疫状态、细胞种类和数量、mRNAmRNA丰度等影响。丰度等影响。l 引物设计，一般可选引物设计，一般可选l55端引物选端引物选IgIg前导肽保守序列，前导肽保守序列，5 5 端引端引物也可选物也可选IgIg分子骨架区分子骨架区1(FR1)1(FR1)的保守序列。的保守序列。
25、l 3 3端引物常选端引物常选J J区保守序列。区保守序列。构建构建FabFab基因基因库，则在重链绞链区和轻链恒定区设计引物。库，则在重链绞链区和轻链恒定区设计引物。l 依据抗体基因家族保守序列设计引物。依据抗体基因家族保守序列设计引物。l 设计多套引物分别扩增。设计多套引物分别扩增。为保证引物与模板为保证引物与模板最大的匹配，扩增出所有基因，有时尚须采用兼最大的匹配，扩增出所有基因，有时尚须采用兼并引物。并引物。l选用丝状噬菌体选用丝状噬菌体(M13(M13、fd)fd)，其，其DNADNA呈单链。呈单链。一般在其外壳蛋白基因信号肽序列与编码成一般在其外壳蛋白基因信号肽序列与编码成熟的蛋白
26、序列之间插入外源基因人熟的蛋白序列之间插入外源基因人IgIg基因片基因片段。用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的段。用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNAcDNA，克隆进入丝状噬菌体载体中，即与外，克隆进入丝状噬菌体载体中，即与外壳蛋白壳蛋白p p 或或pp的基因连接形成融合基因。的基因连接形成融合基因。2 2噬菌体表达载体的构建噬菌体表达载体的构建l 一般插入后不影响表达系统功能，在此一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人融合基因中，人 Ig Ig 基因片段多位于噬菌体基基因片段多位于噬菌体基因的上游因的上游55端，在细菌中可以表达。一般作端，在细菌中可以表达。一般作用的载体都是
27、经过改建的，即含有用的载体都是经过改建的，即含有LacZLacZ启动子、启动子、核糖体结合位点核糖体结合位点(SD(SD序列序列)、前导肽序列、前导肽序列(保证保证分泌分泌)和多克隆位点等，其后为和多克隆位点等，其后为M13M13外壳蛋白外壳蛋白(p(p或或p)p)。3 3重组噬菌体重组噬菌体DNADNA导入细菌进行人导入细菌进行人IgIg片段表达片段表达 表达出的人表达出的人IgIg片段位于噬菌体外壳蛋白片段位于噬菌体外壳蛋白N N端，但此融合蛋白不形成包涵体，在细菌信号端，但此融合蛋白不形成包涵体，在细菌信号肽引导下到达质周腔，肽引导下到达质周腔，IgIg片段在此能自发折叠片段在此能自发折
28、叠成天然状态，恢复生物活性。成天然状态，恢复生物活性。同时，外壳蛋白构成噬菌体外壳后，抗体同时，外壳蛋白构成噬菌体外壳后，抗体分子蛋白处于其分子蛋白处于其N N端，分布在噬菌体表面。端，分布在噬菌体表面。4 4 单链噬菌体有效筛选单链噬菌体有效筛选 抗体库建立后抗体库建立后,用可溶性抗原去筛用可溶性抗原去筛选表达的抗体，在筛选流感病毒血凝素选表达的抗体，在筛选流感病毒血凝素抗体、破伤风类毒素抗体时证明，筛选抗体、破伤风类毒素抗体时证明，筛选率很低。需要改进和提高产率。率很低。需要改进和提高产率。制备固相化抗原柱制备固相化抗原柱 人体内是通过抗原的提呈作用，选择表面呈人体内是通过抗原的提呈作用，
29、选择表面呈现特异抗体的现特异抗体的B B细胞和增殖分泌抗体的浆细胞。细胞和增殖分泌抗体的浆细胞。并在抗原选择压力下发生改变，产生出具有不并在抗原选择压力下发生改变，产生出具有不同亲和力抗体。同亲和力抗体。为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。固相多杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。固相多用层析柱，也有用颗粒物质和酶联孔的。用层析柱，也有用颗粒物质和酶联孔的。抗体库噬菌体过柱抗体库噬菌体过柱 选择目的抗体选择目的抗体 把含有抗体的噬菌体培养把含有
30、抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。此时，抗原柱吸附的带抗体的合的噬菌体。此时，抗原柱吸附的带抗体的噬菌体是具有感染性噬菌体是具有感染性,表面所带抗体是所需的表面所带抗体是所需的特异抗体片段。显然，只要制备不同抗原柱，特异抗体片段。显然，只要制备不同抗原柱，就可筛选到针对不同抗原的不同抗体。就可筛选到针对不同抗原的不同抗体。6 6洗脱结合的噬菌体洗脱结合的噬菌体 选择合适洗脱条件，把结合的、也是所需选择合适洗脱条件，把结合的、也是所需的噬菌体洗下来，收
31、集噬菌体，再去感染细的噬菌体洗下来，收集噬菌体，再去感染细菌进行扩增。菌进行扩增。经过这样一来一轮淘筛方式，经过这样一来一轮淘筛方式，就能把抗体库中与抗原特异性结合抗体选出就能把抗体库中与抗原特异性结合抗体选出来，且能够做到富集。来，且能够做到富集。7 7重复重复“吸附吸附洗洗 脱脱扩增扩增”过程过程 由于每径过一轮淘筛，由于每径过一轮淘筛，可富集可富集202010001000倍，几倍，几轮后很容易扩增到轮后很容易扩增到108108个噬菌体体库。个噬菌体体库。（二）应用（二）应用1 1应用应用“万能库万能库”,”,制备人源抗体、多制备人源抗体、多功能抗体功能抗体 不经免疫已获得许多人的抗半抗原
32、、不经免疫已获得许多人的抗半抗原、蛋白质、多糖及病毒等抗体。蛋白质、多糖及病毒等抗体。2 2抗感染传染病诊断、治疗和预防抗感染传染病诊断、治疗和预防(当当 前重点、热点前重点、热点)。3 3抗肿瘤肿瘤和其他疾病的导向治疗抗肿瘤肿瘤和其他疾病的导向治疗和和 基因治疗。基因治疗。4 4利用抗体信息设计药物。利用抗体信息设计药物。5 5噬菌体表位文库，噬菌体表位文库，可用此表达系统表达特异多肽后，可用此表达系统表达特异多肽后，建立肽库建立肽库（peptide library）。蛋白质工程 (protein engineering）蛋白质的结构及其多样性蛋白质的结构及其多样性氨基酸种类不同，肽链结构不
33、同氨基酸种类不同，肽链结构不同-蛋白质多样性原因蛋白质多样性原因氨基酸数目成百上千，肽链结构不同氨基酸数目成百上千，肽链结构不同 氨基酸排列顺序千变万化，肽链结构不同氨基酸排列顺序千变万化，肽链结构不同-肽链空间结构千差万别，蛋白质种类不同肽链空间结构千差万别，蛋白质种类不同天然蛋白质是生物在长期进化过程中形天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。产和生活的需要。基因工程在原则上只能生产自然基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。界已存在的蛋白
34、质。蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。白质。满足人类满足人类生产和生生产和生活的需要活的需要改造改造干扰素（半胱氨酸）干扰素（半胱氨酸）体外很难保存体外很难保存干扰素（丝氨酸）干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）位的天冬酰胺）改造改造改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶
35、二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍玉米中赖氨酸含量可提高数倍改造改造例如胰岛素改造例如胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已
36、通过临床实验。用。该速效胰岛素已通过临床实验。二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。白质的结构进行分子设计。对天然蛋白质进行改造，对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？对基因的操作来实现？蛋白质的功能是蛋白质的功能是DNA决定的，那么决定的，那么要制要制造出新的蛋白质，就要改造造出新的蛋白质，就要改造DNA，所，所以蛋白质工程的原理应该是中心法以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。则的逆推。蛋白
37、质工程是在基因工程的基础蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。上，延伸出来的第二代基因工程。蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的基本原理基因基因DNA氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链蛋白质蛋白质三维结构三维结构 预期功能预期功能 生物功能生物功能mRNA转录转录翻译翻译折叠折叠DNA合成合成分子设计分子设计（1 1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2 2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3 3）借助核磁共振和）借助核磁共振和X X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构白质的二维重组和三
38、维晶体结构;（4 4）设计各种处理条件，了解蛋）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；叠等对其活性与功能的影响；（5 5）设计编码该蛋白的基因改造）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；方案，如点突变；（6 6）分离、纯化新蛋白，功能检）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。测后投入实际使用。蛋白质结构测定蛋白质结构测定一级结构测定：一级结构测定：直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基
39、酸顺序。蛋白质的氨基酸顺序。三级结构测定：三级结构测定：X-X-射线晶体衍射射线晶体衍射研究处在晶体状态下的蛋白质研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构的空间结构核磁共振核磁共振(NMR)(NMR)光谱光谱研究处在溶液状态的蛋白研究处在溶液状态的蛋白质的结构。质的结构。蛋白质工程的主要手段蛋白质工程的主要手段 以重组以重组DNADNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。位点特异性突变位点特异性突变结构生物学、信息生物学结构生物学、信息生物学基因突变基因突变 随机突变随机突变基于高通量筛选法基于高通量筛选法 基因内部的剪接基因内部的剪接基因剪接基因剪接 5 5或
40、或3 3端的剪接端的剪接l小改是对天然蛋白质的一个或几个氨基酸残基小改是对天然蛋白质的一个或几个氨基酸残基进行修改。它往往利用点突变的技术，在维持进行修改。它往往利用点突变的技术，在维持蛋白质原有功能的基础上，改进某一些性质特蛋白质原有功能的基础上，改进某一些性质特点。点。基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。突变点：人工合成的引物上手段：PCR技术目的：获得定点突变的基因位点特异性突变：通过特异地改变编码核苷酸从而替代蛋白质中的某个氨基酸。可高效、准确地得到蛋白质突变体。但这种方法得到的突变体数量有限，因此在操作技术的带动下，发现了随机突变法。l设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体。类
41、胰岛素生长因子I(IGFI)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGFI不形成二聚体。IGFI的B结构域（与胰岛素B链相对应）中B28B29氨基酸序列与胰岛素B链的B28B29相比，发生颠倒。因此，将胰岛素B链改为B28LysB29Pro，获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床实验。l枯草杆菌碱性蛋白酶(重要工业用酶)l对碱、热、氧化作用抗力差，易失活。lMet/Ala(222),成功地制备出具有耐碱、耐热以及抗氧化的各种新特性的蛋白酶。l胰蛋白酶（LysArg）l易自溶失活l对自溶片段分析，对Arg117进行设计，引入缺失突变。稳定性大大提高。l表面电荷正改负，在较
42、高pH条件下提高了其专一性（LysArg）。l葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高1012；酶比活相同 中改是对蛋白质分子中某些结构单元或肽段进行分子裁剪，通过基因操作，在不同的蛋白质分子之间替换结构单元，以期得到新的功能组合。基因剪接：在酶分子的编码基因上剪去或接上一段核苷酸。融合蛋白质 将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白
43、质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。（结构域的拼接）这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性l 脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与型受体结合的基本功能区域，干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。化学合成EnkN端5肽编码区，通过连接5肽编码区与人1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。l大改 是重新设计与合成自然界本不存在的蛋
44、白质分子。即从蛋白质的氨基酸组成和顺序出发，设计并制造出一个全新的蛋白质，并使之具有特定的空间结构和相应的功能。定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋白操作时更应注意。对 糖 蛋 白 的 N 糖 基 化 位 点（AsnXSer/TheXPro）应予注意。分泌蛋白、穿膜蛋白的这些位点若改变，将影响其糖基化，则可能对生物活性有影响。故注意对天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸加以保护。应注意 疏水氨基酸常出现在蛋白质活性中心区，故应保留脯氨酸（可终止螺旋区），半胱氨酸（形成二硫键，这是分泌蛋白标志之一）。螺旋，折叠区一般不会存在酶的活性中心及底物的结合中心，只是结构支架。而环区，转角区和带电荷区多位蛋白质表面，可能是底物结合区和配基结合部位，应予注意。对于有内含子的基因序列，可以试着去删除某一外显子，观察对功能影响。由于单个外显子一般编码独立折叠结构删去后不会影响其余部分的折叠。构建嵌合蛋白时，若是同源蛋白嵌合体（30%同源），结合部应是相同或相近功能氨基酸；若是非同源原蛋白质，接合部应在预测结构的边缘。
