1、第五章第五章 酶工程制药酶工程制药l第一节第一节 概述概述l第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化*l第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化*l第四节第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器*l第五节第五节 固定化酶产品介绍固定化酶产品介绍第一节第一节 概述概述一、酶的基础知识一、酶的基础知识（一）酶是生物催化剂（一）酶是生物催化剂酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。剂。催化高效性：催化高效性：1081020专一性：专一性：结构专一性；结构专一性；立体异构专一性立体异构专一性酶具有不稳定性酶具有不稳定性（二）酶
2、的化学本质（二）酶的化学本质蛋白质蛋白质酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）（全酶）=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶与酶蛋白结合得牢固的小分子有机物。与酶蛋白结合得牢固的小分子有机物。辅基辅基与酶蛋白结合得松散的小分子有机物。与酶蛋白结合得松散的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。4必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。酶的活性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。催化作用直接有关的部位。必需基团必需基团活
3、性部位活性部位维持酶的空间结构维持酶的空间结构结合基团结合基团催化基团催化基团专一性专一性催化性质催化性质二、现代酶工程的主要内容：二、现代酶工程的主要内容：1.1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；用开发；2.2.酶和细胞的酶和细胞的固定化固定化及及酶反应器酶反应器的研究，包括的研究，包括酶传感器、反应检测；酶传感器、反应检测；3.3.酶生产中酶生产中基因工程技术基因工程技术的应用及的应用及遗传修饰酶遗传修饰酶的研究；的研究；4.4.酶的分子酶的分子改造改造和化学和化学修饰修饰，结构与功能的研，结构与功能的研究；究；5.5.有机相中酶反应有机
4、相中酶反应的研究；的研究；6.6.酶的酶的抑制剂、激活剂抑制剂、激活剂的开发与应用研究；的开发与应用研究；7.7.抗体酶抗体酶、核酸酶核酸酶的研究；的研究；8.8.模拟酶、合成酶模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研及酶分子的人工设计、合成研究。究。三、酶的来源和生产三、酶的来源和生产（一）酶的来源（一）酶的来源 酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成或基因工程生产的。的是合成或基因工程生产的。l早期酶的生产：以动植物为主要原料，如早期酶的生产：以动植物为主要原料，如激肽释放酶激肽释放酶（胰脏）（胰脏）、菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶、木瓜
5、蛋白酶木瓜蛋白酶。l近近1010年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。长、成本高。微生物生产酶的特点微生物生产酶的特点1.1.微生物微生物种类繁多种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都，凡是动植物体内存在的酶，几乎都能从微生物中得到；能从微生物中得到；2.2.微生物微生物繁殖快繁殖快、生、生产周期短产周期短、培养简便培养简便，并可通过控，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；制培养条件来提高酶的产量；3.3.微生物具有微生物具有较强的适应性较强的适应性，通过各种，通过各种遗传变异遗传变异的手段，的手段，能培育出新的高产菌株。能培育出新的
6、高产菌株。四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用1.1.在疾病诊断方面的应用在疾病诊断方面的应用由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简和等催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。酶学诊断方法：酶学诊断方法：1 1）是根据体内）是根据体内原有酶活力的变化原有酶活力的变化来诊断某些疾来诊断某些疾病；病；2 2）利用酶来测定体内某些物质的含量利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊，从而诊断某些疾病。断某些疾病。10根据体内酶活力的
7、变化诊断疾病根据体内酶活力的变化诊断疾病:一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。诊断出某些疾病。胰腺癌：胰蛋白酶、胰型同胰腺癌：胰蛋白酶、胰型同工酶等升高工酶等升高肝炎：转氨酶升高肝炎：转氨酶升高 12用酶测定用酶测定体液中体
8、液中某些物质的变化诊断疾病：某些物质的变化诊断疾病：人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某些疾病。某些疾病。2.2.在疾病治疗方面的
9、应用在疾病治疗方面的应用-酶类制剂酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为的酶称为药用酶药用酶。药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛。病的治疗方面的应用越来越广泛。溶菌酶：抗菌消炎和镇溶菌酶：抗菌消炎和镇痛痛1 1）消化类：）消化类：研究最早，是品种最多的一类酶研究最早，是品种最多的一类酶。在这一类酶中主要有胃蛋白酶、在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等等。健美
10、生消化酶健美生消化酶帮助肠胃蠕动帮助肠胃蠕动2 2）抗炎净创类）抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。多数是蛋白质水解酶，多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝结物分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使生成简单的嘌呤和嘧其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使生成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、排除脓液、抗炎消肿的啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、排除脓液、抗炎消肿的目的。目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶、主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、
11、双链酶、-淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。3 3）血凝和解凝类：）血凝和解凝类：都是从血液中提取出来的。都是从血液中提取出来的。凝血酶的作用凝血酶的作用：促使血中纤维蛋白原变成不溶性纤促使血中纤维蛋白原变成不溶性纤维蛋白维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。例从而促使血液凝固，防止微血管出血。例如：蛇毒抗凝酶、促凝血酶原激酶。如：蛇毒抗凝酶、促凝血酶原激酶。3 3）血凝和解凝类：）血凝和解凝类：纤维蛋白溶解酶的作用：纤维蛋白溶解酶的作用：使血块溶解，为目前临床使血块溶解，为目前临床上最新的一种酶制品上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓
12、塞等。例如栓塞等。例如:东菱克栓酶东菱克栓酶抑肽酶作为肽酶抑制剂：抑肽酶作为肽酶抑制剂：广泛应用于体外循环手术，广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡。4 4）解毒类：）解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的有主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的有害物质。害物质。主要品种有主要品种有青霉素酶青霉素酶、过氧化氢酶过氧化氢酶和和组织胺酶组织胺酶等。等。青霉素酶能够分解青霉素分子（青霉噻唑）中的青霉素酶能够分解青霉素分子（青霉噻唑）中的一内酰
13、胺环，使变成青霉素铜酸，消除因注射一内酰胺环，使变成青霉素铜酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应青霉素引起的过敏反应。5 5）抗肿瘤的药用酶：）抗肿瘤的药用酶：L-L-天冬酰胺酶是第一种用于治疗白血病的酶；天冬酰胺酶是第一种用于治疗白血病的酶；癌细胞缺乏天冬酰胺合成酶，自身生长时不能合癌细胞缺乏天冬酰胺合成酶，自身生长时不能合成天冬氨酸，成天冬氨酸，L-L-天冬酰胺酶可以切断外来的天天冬酰胺酶可以切断外来的天冬酰胺供给。冬酰胺供给。21酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一类常用的免疫酶技术，将已知的是一类常用的免疫酶技
14、术，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，用酶标记抗原或抗体吸附在固相载体表面，用酶标记抗原或抗体，使抗原抗体反应在固相表面进抗原或抗体，使抗原抗体反应在固相表面进行，检测液体中未知抗体或抗原的方法。行，检测液体中未知抗体或抗原的方法。在在ELISAELISA方法中有三个必要的试剂：方法中有三个必要的试剂：固相的抗原或抗体，即固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂免疫吸附剂”（immunosorbentimmunosorbent）酶酶标记的抗原或抗体，称为标记的抗原或抗体，称为“结合物结合物”（conjugateconjugate）酶反应的底物（显色剂）酶反应的底物（显色剂）ELISA的基本方法的基
15、本方法微孔板微孔板包被抗体包被抗体加样品加样品(抗原抗原)孵育孵育洗涤洗涤加酶联二抗加酶联二抗(辣辣根过氧化物酶根过氧化物酶)孵育孵育洗涤洗涤孵育孵育加终止液加终止液(硫酸溶液硫酸溶液)加底物加底物(邻苯邻苯二胺二胺)显色显色比色比色包被抗体的酶包被抗体的酶标反应板标反应板 加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤未结彻底洗涤未结合的酶标抗体合的酶标抗体 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行抗原的程度进行抗原的定性或定量测定定性或定量测定双抗体夹心法双
16、抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，先将已知抗体连接法，先将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体体-待测抗原待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成正比。正比。间接法间接法 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
17、体，故称为间接法。第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化*第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化*第四节第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器*30第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化*一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备l1 1、固定化酶的定义、固定化酶的定义:指限制或固定于特定空间位指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的
18、过程称为酶的固定化。酶的固定化。l固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。31 2、固定化酶的特点、固定化酶的特点l（1 1）可以多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提高；l（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。无残留酶，易于纯化。l（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；化和自动控制；l（4 4）酶的利用率高，单位酶
19、催化的底物量增加，）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；用酶量少；l（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法热处理热处理（细胞）（细胞）物理吸物理吸附法附法共价结共价结合法合法离子结离子结合法合法载体结载体结合法合法交联交联法法包埋包埋法法网格型网格型微囊型微囊型3.酶的固定化方法与技术酶的固定化方法与技术3334第五节第五节 固定化酶产品介绍固定化酶产品介绍(1)(1)氨基酰化酶氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种固定化酶，可以用于生产各种L-L-氨基酸
20、药物。氨基酸药物。19691969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用得到的氨基酰化酶，用DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶为载体通葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将过离子键结合法制成固定化酶，将L-L-乙酰氨基酸水乙酰氨基酸水解生成解生成L-L-氨基酸，用来拆分氨基酸，用来拆分DL-DL-乙酰氨基酸，连续乙酰氨基酸，连续生产生产L-L-氨基酸。剩余的氨基酸。剩余的D-D-乙酰氨基酸经过消旋化，乙酰氨基酸经过消旋化，生成生成DL-DL-乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的
21、用游离酶生产成本的6060左右。左右。固定化酶法生产固定化酶法生产L-L-氨基酸氨基酸乙酰乙酰-D DL LAla Ala L LAlaAla+乙酰乙酰-D DAlaAlaAminoacylaseAminoacylase氨基酰化酶氨基酰化酶泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子固定化酶柱子DEAE-葡聚糖葡聚糖氨基酰化酶氨基酰化酶晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala(2 2)青霉素酰化酶青霉素酰化酶：是在药物生产中广泛应用的一：是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。种固定化酶。可用多种方法固定化。19731973年已
22、用年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pHpH等条等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6 6一一氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6(6一一APA)APA)或或7 7一氨基头孢霉烷酸一氨基头孢霉烷酸(7(7一一ACA)ACA)，也可以催化，也可以催化6 6一一APAAPA或或7 7一一ACAACA与其他的羧酸与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头
23、孢霉素。的青霉素或头孢霉素。固定化细胞法生产固定化细胞法生产6-6-氨基青霉烷酸（氨基青霉烷酸（6-APA6-APA）青霉素G（或青霉素V）经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6-氨基青霉烷酸（6-APA），也称无侧链青霉素。6-APA是生产半合成青霉素的最基本原料。E.Coli D-816培养E.Coli 细胞液细胞液固定化细胞固定化细胞固定青霉素G（V）转化液转化滤液6APA过滤抽提作业：作业：1、酶在医药领域的应用？、酶在医药领域的应用？2、酶联免疫吸附法的原理和流程？、酶联免疫吸附法的原理和流程？401 1、细胞破碎、细胞破碎2 2、酶的提取、酶的提取3 3、酶的分离方法、酶的
24、分离方法4 4、酶的组合分离纯化策略、酶的组合分离纯化策略5 5、酶的浓缩、干燥与结晶、酶的浓缩、干燥与结晶第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化*一、酶的分离纯化技术路线一、酶的分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。42二、酶的提取二、酶的提取（一）（一）细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内
25、酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1 1）机械破碎）机械破碎2 2）物理破碎）物理破碎3 3）化学破碎）化学破碎4 4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎高压细胞破碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机431.1.采用缓冲体系：防采用缓冲体系：防PHPH大幅度变化而失活大幅度变化而失活2.2.添加保护剂：防活性基团活性中心受影响添加保护剂：防活性基团活性中心受影响3.3.抑制水解酶的作用：加酶抑制剂抑制水解酶的作用：加酶抑制剂4.4.其他保护措施：温度，其他保护措施：温度，PHPH，搅拌，
26、光照，氧化等，搅拌，光照，氧化等影响影响为了保护目的酶的生物活性，常采取下列保护为了保护目的酶的生物活性，常采取下列保护措施：措施：44（二）酶的（二）酶的抽提抽提将酶从生物组织或细胞破碎液以溶将酶从生物组织或细胞破碎液以溶解状态最大限度释放出来的过程。解状态最大限度释放出来的过程。45(三）沉淀分离三）沉淀分离粗提物：经细胞破碎和抽提后，得粗提物：经细胞破碎和抽提后，得到的含目的酶的无细胞抽提物。到的含目的酶的无细胞抽提物。46（四）、酶的纯化（四）、酶的纯化过滤与膜分离过滤与膜分离电泳电泳离子交换层析离子交换层析47第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化*一、固定化酶的制备一、固定
27、化酶的制备1 1、固定化酶的定义、固定化酶的定义:指限制或固定于特定空间位指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。48 2、固定化酶的特点、固定化酶的特点（1 1）可以
28、多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。无残留酶，易于纯化。（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；化和自动控制；（4 4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；用酶量少；（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法热处理热处理（细胞）（细胞）物理吸物理吸附法附法共价结共价结合法合法离子结离子结合
29、法合法载体结载体结合法合法交联交联法法包埋包埋法法网格型网格型微囊型微囊型3.酶的固定化方法与技术酶的固定化方法与技术5051（1 1）载体结合法）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。化方法。A.A.物理吸附法：物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃多孔玻璃,树脂等树脂等优点优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再用。后载体仍可再用
30、。缺点：缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。于脱落，导致酶活下降并污染产物。52 B B、离子结合法：、离子结合法：酶通过离子键结酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性合于具有离子交换基的水不溶性载体上。载体上。DEAE-纤维素等纤维素等优点：优点：操作简单，处理条件温和，操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。酸残基不易被破坏。缺点：缺点：载体和酶的结合力弱，易受载体和酶
31、的结合力弱，易受缓冲液种类或缓冲液种类或pH的影响，离子的影响，离子强度高时，酶易脱落。强度高时，酶易脱落。53C、共价结合法：、共价结合法：酶以共酶以共价键结合于载体上。即将价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。行共价结合的方法。优点：优点：酶与载体结合牢固，酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落稳定性好，不易脱落。缺点：缺点：反应条件苛刻，操反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻酶易失活和产生空间位阻效应。效应。54（2）交联法）交联法：用双功能或多用双功能或
32、多功能试剂使酶与酶或细胞与功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。细胞之间交联的方法。交联法交联法交联酶法交联酶法酶与辅助蛋白交联法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法吸附交联法载体交联法载体交联法常用的交联剂：戊二醛、双常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺重氮联苯胺-2-2、2-2-二磺酸、二磺酸、1,5-1,5-二氟二氟-2,4-2,4-二硝基苯。二硝基苯。55酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；酶分子；（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；溶性的固定
33、化酶；（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶56（3）包埋法：）包埋法：A、网格型：、网格型：将酶或细胞包埋在将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶，胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶，多用于固定化细胞。多用于固定化细胞。57B、微囊型、微囊型：将酶或细胞包将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米
34、到几百微通常为直径几微米到几百微米的球状体。米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成但反应条件要求高，制备成本也高。本也高。5859新型的酶固定化方法新型的酶固定化方法温和的条件温和的条件下进行，减少酶活力损失，提下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率高固定化效率光偶联法：光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定化光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶无载体固定化酶：无载体固定化酶：直接用交联剂交联直接用交联剂交联用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集
35、酶、用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，。60无载体固定化酶无载体固定化酶优点如下：优点如下：1.催化活性高，成本低催化活性高，成本低2.具备较高的催化剂比表面具备较高的催化剂比表面3.可加入多种酶可加入多种酶4.底物扩散受限制少底物扩散受限制少5.极端条件下稳定性高极端条件下稳定性高二、二、固定化细胞的制备固定化细胞的制备1 1、固定化细胞：、固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细
36、胞，它与固定化定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。酶同被称为固定化生物催化剂。固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系比固定化酶更普遍。比固定化酶更普遍。如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、叶绿体及微粒体等细胞器的固定化。叶绿体及微粒体等细胞器的固定化。2 2、固定化细胞的特点、固定化细胞的特点为什么要固定化？为什么要固定化？EE颗粒小、难于截流或定位，颗粒小、难于截流或定位，而固定化细胞不仅兼具细胞特性、生物催化功能而固定化细胞不仅兼具细胞特性、生物催化功能及固相催化剂特点。及固相催化剂
37、特点。特点：特点：无需进行酶的分离纯化；无需进行酶的分离纯化；细胞保持酶的原始状态，故酶活回收率高；细胞保持酶的原始状态，故酶活回收率高；细胞内酶比固定化酶稳定性更高；细胞内酶比固定化酶稳定性更高；细胞内酶的辅因子可以自动再生；细胞内酶的辅因子可以自动再生；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；抗污染能力强。抗污染能力强。3 3、固定化细胞的制备技术、固定化细胞的制备技术固定化酶主要适用于细胞内酶，固定化酶主要适用于细胞内酶，底物和产物易于底物和产物易于透过细胞膜，透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其它细胞内不存在产物分解系统及其它副反应。副反应。固定
38、化细胞技术主要有载体结合法、包埋法、交固定化细胞技术主要有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法。这些技术与前面提到的相关固联法及无载体法。这些技术与前面提到的相关固定化酶的技术类似定化酶的技术类似。64三、固定化方法的选择依据三、固定化方法的选择依据1.1.固定化方法的选择固定化方法的选择（1 1）固定化酶应用的安全性固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。择无毒性试剂。（2 2）固定化酶在操作中的稳定性固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化
39、方法时要求：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。上有极强的竞争力。（3 3）固定化的成本固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设电、气、设 备和劳务投资等备和劳务投资等。652 2、载体的选择、载体的选择 一般是为了工业化生产，因此性能好、价格便宜是一项重一般是为了工业化生产，因此性能好、价格便宜是一项重要的指标。如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树要的指标。如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等
40、都是有应用前途的载体。脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。酶。l3.常用的固定化酶载体材料（自学）四、固定化酶（细胞）的性状和性质四、固定化酶（细胞）的性状和性质*1 1、固定化酶的形状、固定化酶的形状（1 1）颗
41、粒状：）颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。用各种反应器。如酵母酶珠。（2 2）纤维状：）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。充床反应
42、器。67（3 3）膜状固定化酶：）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。（4 4）管状固定化酶：）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙、又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。
43、酶管的机械强度大，切断后可用于填充床反应器，也可组装管的机械强度大，切断后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。等酶管。2 2、固定化酶的性质、固定化酶的性质 （1 1）酶活力的变化：）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力酶经过固定化之后活力大都下降大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。包
44、埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。（2 2）酶稳定性的变化：）酶稳定性的变化：包括对温度、包括对温度、pHpH、蛋白酶变性、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命稳定性提高，有效寿命延长延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。溶，增加了酶构型的牢固程度。操作稳定性；操作稳定性；贮藏稳定性；贮藏稳定性；对蛋白酶的稳定性。对蛋白酶的稳定性。（3 3）酶学特性的变化）酶学特性的变化 A A、底物专一性：对底物的专一性、底物专一性：对底物的专一性下降下降。B
45、B、最适、最适pHpH：最适：最适pHpH可能变大，也可能变小；可能变大，也可能变小；pH-pH-酶活酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。C C、最适温度：、最适温度：一般升高一般升高。原因是固定化后空间结构更。原因是固定化后空间结构更为稳定。为稳定。D D、最大反应速度（、最大反应速度（VmVm）：变化很小或不变。）：变化很小或不变。70五、评价固定化酶（细胞）的指标五、评价固定化酶（细胞）的指标1.1.固定化酶活力测定固定化酶活力测定活力回收率活力回收率=固定化酶总活力固定化酶总活力/加入酶的总活力加入酶的总活力相
46、对活力固定化酶总活力相对活力固定化酶总活力/（加入酶的总活力上清液（加入酶的总活力上清液中未偶联的酶活力）中未偶联的酶活力）2.2.偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的测定第四节第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量72常见的酶反应器类型常见的酶反应器类型（了解）（了
47、解）l按按结构结构区分区分搅拌罐式反应器（搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor,STRStirred Tank Reactor,STR）鼓泡式反应器鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)(bubble column reactor,BCR)填充床式反应器填充床式反应器(packed column reactor,PCR)(packed column reactor,PCR)流化床式反应器流化床式反应器(Fluidized Bed Reactor,FBR)(Fluidized Bed Reactor,FBR)膜反应器膜反应器(Membrane Re
48、actor,MR)(Membrane Reactor,MR)l按按操作方式操作方式区分区分分批式反应分批式反应(batch)(batch)连续式反应连续式反应(continuous)(continuous)流加分批式反应流加分批式反应(feeding batch)(feeding batch)l混合形式混合形式连续搅拌罐反应器（连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Continuous Stirred Tank Reactor,CSTRReactor,CSTR）分批搅拌罐反应器（分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor,Batch St
49、irred Tank Reactor,BSTRBSTR）73一、反应器的类型和特点一、反应器的类型和特点1.间歇式搅拌罐反应器间歇式搅拌罐反应器用于游离酶反应后随即放料。用于游离酶反应后随即放料。又称为批量反应器。又称为批量反应器。特点特点：底物与酶一次性投入反应器内，底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。再转入下一批反应。优点优点：装置较简单，造价较低：装置较简单，造价较低缺点缺点：固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，：固定化酶经反复回收使用时，易
50、失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶化酶，但常用于游离酶。75 连续流动搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器连续进料、连续出料连续进料、连续出料连续搅拌釜式反应器连续搅拌釜式反应器。向反应器。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液同时，以相同流速输出反应液（含产物）。（含产物）。底物溶液进口底物溶液进口 反应液出口反应液出口 优点优点：混合良好，各部分组成相同
