1、共同特点共同特点大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病；疹性疾病；以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；除了少数外全是专性活细胞内寄生；除了少数外全是专性活细胞内寄生；菌体内同时含有菌体内同时含有DNADNA和和 RNARNA两类核酸；两类核酸；以二分裂方式进行繁殖；以二分裂方式进行繁殖；对抗生素敏感。对抗生素敏感。第2页/共103页一、斑疹伤寒立克次体(一一)临床意义
2、临床意义 1普氏立克次体是流行性斑疹伤寒普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传又称虱传 斑疹伤寒斑疹伤寒)的病原体。的病原体。病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，介，而非储存宿主。而非储存宿主。传播方式为虱传播方式为虱-人人-虱，体虱仅是传染媒介。虱，体虱仅是传染媒介。第3页/共103页莫氏立克次体莫氏立克次体n地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒又称鼠型斑疹伤寒)的病原的病原体。啮齿类动物是主宿主，传播媒介是鼠体。啮齿类动物是主宿主，传播媒介是鼠蚤或鼠虱。蚤或鼠虱。n鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤
3、寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地在人群中传播。在人群中传播。第4页/共103页致病物质致病物质n有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖(LPS)；其二为磷脂酶其二为磷脂酶A,能损伤宿主细胞膜能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长。主细胞并在其中生长。n普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。似，
4、以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤。器官损伤。第5页/共103页(二二)微生物特性微生物特性1.比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团集成团,分布在胞质内分布在胞质内,Gimenez法染色后法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构。呈红色，外表含有微荚膜结构。2.必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需要需要C02。通常采用通常采用5-9日龄鸡胚作卵黄囊日龄鸡胚作卵黄囊接种，于接种，于32-35孵育孵育413d内死亡，鸡内死亡，鸡胚死亡时
5、间与接种剂量大小呈直接相关。普胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关。普氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。第6页/共103页3.有群特异性和种特异性两种抗原。大部分有群特异性和种特异性两种抗原。大部分立克次体与普通变形杆菌立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐菌株的菌体耐热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反应，可供
6、辅助诊断。应，可供辅助诊断。第7页/共103页 外斐反应外斐反应 立克次体病立克次体病 变形杆菌变形杆菌 OX19OX19变形杆菌变形杆菌 OX2OX2变形杆菌变形杆菌 OXkOXk流行性斑疹伤寒流行性斑疹伤寒+-地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒+-斑点热斑点热+/+/+/+/+-恙虫病恙虫病-+腺热腺热-+第8页/共103页鸡胚是培养的极好宿主。直接涂片镜检 采用Giemsa、碘液或荧光抗体染色镜检，检查上皮细胞内有无包涵体。悬液)制片，以低稀释度的病人血清初筛，特异性几乎为100，主要依赖引物的特异性。Starry染色能查见多形性菌体。克体的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆，可用必要时用补体结合试
7、验、微量凝集试验等，作群和种的鉴定。分布在细胞质内，密集于定液，加盖玻片，在荧光显微镜下检查感用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。沙眼衣原体Chlamydia trachomatis开始皮肤出现红丘疹，偶有溃疡。体结合抗原，应用于血清学诊断。沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用68d龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。(3)泌尿生殖道感染：(三三)微生物检验微生物检验1.1.标本采集标本采集(1)(1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症，病人血液标本：发热期均有立克次体血症，在急性期较易检出立克次体。争取在用抗生在急性期较易检出立
8、克次体。争取在用抗生 素前采血，立即床侧接种。素前采血，立即床侧接种。(2)(2)活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本。瓣膜等标本。第9页/共103页2.2.标本直接检查标本直接检查(1)免疫荧光检测免疫荧光检测 用于脏器检查。制备标本片用于脏器检查。制备标本片薄而均匀，组织结构清晰，固定后用荧光抗薄而均匀，组织结构清晰，固定后用荧光抗体染色体染色,常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体，常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。(2)核酸检测核酸检测 PCR敏感性高，所需样品量只需敏感性高，
9、所需样品量只需ELISA实验的实验的15。以编码。以编码17kD蛋白的基因蛋白的基因和编码普氏和莫氏立克次体和编码普氏和莫氏立克次体169kD蛋白的基因蛋白的基因作为扩增靶区。作为扩增靶区。第10页/共103页n引物引物R17-1、-2在在65条件下能扩增普氏和莫条件下能扩增普氏和莫氏立克次体氏立克次体DNA。在琼脂凝胶上产生一条在琼脂凝胶上产生一条340bp的核酸带；的核酸带；n引物引物R169-1、-2仅能扩增普氏立克次体仅能扩增普氏立克次体DNA，产生一条产生一条432bp的核酸带。两种引物同时使的核酸带。两种引物同时使用，扩增后普氏可产生用，扩增后普氏可产生340bp和和432bp两条
10、带，两条带，而莫氏只产生而莫氏只产生340bp一条带。一条带。n该法敏感性可达该法敏感性可达005ngDNA水平，重复性水平，重复性好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价值。值。第11页/共103页3 3分离培养分离培养(1)动物接种动物接种 选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现象。每日测体温，至象。每日测体温，至40发热时采血或脏器发热时采血或脏器悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立克次体；克次体；感
11、染莫氏立克次体豚鼠在发热感染莫氏立克次体豚鼠在发热12日内出现日内出现阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充血、脾大血、脾大2-3倍，有腹水；有阴囊反应者，睾倍，有腹水；有阴囊反应者，睾丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物等。鞘膜涂片可查到立克次体。等。鞘膜涂片可查到立克次体。第12页/共103页(2)(2)鉴定鉴定n用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。抗原测定动物恢复期血清
12、中的相应抗体。必要时用补体结合试验、微量凝集试验等，必要时用补体结合试验、微量凝集试验等，作群和种的鉴定。作群和种的鉴定。第13页/共103页(3)(3)分离株繁殖及保存分离株繁殖及保存鸡胚卵黄囊培养鸡胚卵黄囊培养 收获卵黄囊，经涂片染收获卵黄囊，经涂片染色镜检色镜检,含立克次体较多而又未发现细菌含立克次体较多而又未发现细菌的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬液置液置-70冰箱保存，或冰冻干燥保藏；冰箱保存，或冰冻干燥保藏；细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、HeLa等细胞，接种培养、鉴定后将立克等细胞，接种培养、鉴定后将立克次体
13、大量繁殖的感染细胞置次体大量繁殖的感染细胞置-70储存。储存。第14页/共103页4 4抗体检测抗体检测立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐反应、间接免疫荧光反应、间接免疫荧光(IFA)试验、酶联免试验、酶联免疫吸附试验疫吸附试验(ELISA)外，还有补体结合外，还有补体结合(CF)试验、微量凝集试验、微量凝集(MA)试验、间接血凝试验、间接血凝(IHA)试验、胶乳凝集试验、胶乳凝集(LA)试验等试验等。第15页/共103页(1)(1)外斐反应外斐反应除除Q热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性外，其他为阳性。外，其他为阳性
14、。患者患者OX凝集素上升较晚，在病程凝集素上升较晚，在病程2周左右方出周左右方出现阳性，病程中双份血清试验，若效价有现阳性，病程中双份血清试验，若效价有4倍倍增长，方有诊断意义。增长，方有诊断意义。第16页/共103页有些病例在病程中效价不见上升，约有些病例在病程中效价不见上升，约15的的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。斑点热病人外斐反应效价通常为斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于高于OX2，但也有但也有OX2
15、较高者。若仅出现较高者。若仅出现OX2阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。第17页/共103页(2)IFA试验试验为现在诊断立克次体病常用的方法。用已知为现在诊断立克次体病常用的方法。用已知立克次体抗原立克次体抗原(感染鸡胚卵黄囊或细胞培养感染鸡胚卵黄囊或细胞培养悬液悬液)制片，以低稀释度的病人血清初筛，制片，以低稀释度的病人血清初筛，有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者，有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者，判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作双倍或双倍或4 4倍稀释以测效价，如呈倍稀释以测效价，如呈4 48 8倍增长倍增长
16、者可明确诊断。者可明确诊断。第18页/共103页(3)ELISAn检测检测IgMIgM抗体对早期诊断有价值。抗体对早期诊断有价值。n立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上ELISAELISA测测定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片(经氯仿经氯仿甲醇洗净甲醇洗净)上，凉干、固定，加稀释血清上，凉干、固定，加稀释血清于抗原点上，每张玻片上包括阳性和阴性对照，加于抗原点上，每张玻片上包括阳性和阴性对照，加酶标兔抗人酶标兔抗人IgM/
17、GIgM/G于抗原于抗原血清点作用后，将浸透新血清点作用后，将浸透新鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约4-64-6minmin，可可见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条(即终止反应即终止反应)，观察是否显色，与对照比较判定结，观察是否显色，与对照比较判定结果。此法简便，并可保存实验记录。果。此法简便，并可保存实验记录。第19页/共103页(4)CF试验试验 CF试验原来是立克次体病血清学诊断的试验原来是立克次体病血清学诊断的经典试验，虽然敏感性不如经典试验，虽然敏感性不如IFA和和 ELISA，但非常特异。一
18、般在立克次体病发病一周内，但非常特异。一般在立克次体病发病一周内，血清中即有血清中即有CF抗体出现，以后逐渐上升，抗体出现，以后逐渐上升，至第至第3周达最高峰，然后逐渐降至较低的效周达最高峰，然后逐渐降至较低的效价，并可保持几年不消失，但也有在病后几价，并可保持几年不消失，但也有在病后几周即转阴性者。病人恢复期血清与斑疹伤寒周即转阴性者。病人恢复期血清与斑疹伤寒群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳性结果，只能说明该群立克次体的感染性结果，只能说明该群立克次体的感染。第20页/共103页(1)间接免疫荧光(1FA)：肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只有一
19、个血清型，是一种重要的呼吸道病原体。分离培养 采用感染组织的刮取物或分泌物，接种鸡胚卵黄囊或传代细胞（常用的是经放线菌酮处理的单层McCoy细胞，或HeLa-229细胞及BHK21细胞），用直接免疫荧光法或酶联免疫法检测。核苷酸，始于ATG起始密码子，终于病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，病原体的携带和传播者，故与莱姆病的有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。1发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发育周期。rRNA序列等加以鉴定。但不能用于埃立克体病的早期诊断。5石炭酸溶液24h杀死沙眼衣原体，2来苏仅需5min。衣原体是一类严格细胞内寄生，有独特发育
20、周期，能通过细菌滤器的原核细胞型微生物.地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒)的病原体。种特异抗原 外膜蛋白MOMP沙眼亚种、LGV亚种、鼠亚种三、恙虫病立克次体三、恙虫病立克次体 又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成黑组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成黑色焦痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫色焦
21、痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫源性疾病。源性疾病。第21页/共103页(一一)微生物特性微生物特性1具有多形性，但以短杆状为常见。具有多形性，但以短杆状为常见。G-,姬姆姬姆 萨染色呈紫红色萨染色呈紫红色,Gimenez染色呈暗红色，染色呈暗红色，背景为绿色。可以鉴别恙虫病立克次体和背景为绿色。可以鉴别恙虫病立克次体和 其他立克次体。分布在细胞质内，密集于其他立克次体。分布在细胞质内，密集于 细胞核旁。细胞内寄生细胞核旁。细胞内寄生。第22页/共103页2培养特性培养特性(1)动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘液涂片检查，可见细胞质内有大量立克次液涂片
22、检查，可见细胞质内有大量立克次体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于细胞核旁。细胞核旁。第23页/共103页(2)细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细胞内生长、繁殖，多采用胞内生长、繁殖，多采用Vero、L929细胞细胞进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸附时间，通常以附时间，通常以37吸附吸附1h，培养培养32为为宜，繁殖缓慢，用宜，繁殖缓慢，用Vero细胞培养细胞培养89d，在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密集，但不侵入细胞核。集，但不侵入细胞核。
23、第24页/共103页3 3抗原成分抗原成分n恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异性抗原。性抗原。n恙虫病立克次体和变形杆菌恙虫病立克次体和变形杆菌OXk株有共同的株有共同的抗原成分，在抗原成分，在Weil-Felex反应中，血清与反应中，血清与OX，抗原发生凝集而不与抗原发生凝集而不与OX19、OX2发生凝集。发生凝集。第25页/共103页(二二)微生物检验微生物检验(1)抗原检测：抗原检测：ELISA间接法是检测标本的特异间接法是检测标本的特异性抗原或抗体的最常用方法。性抗原或抗体的最常用方法。(2)PCR：可检出可检出20ng恙虫病立克次体恙虫病立克
24、次体DNA；套套式式PCR法可检出法可检出200pg，是目前最为快速、特是目前最为快速、特异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期患者的早期诊断。患者的早期诊断。依据依据56KD蛋白抗原基因或蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因蛋白抗原基因序列选择引物，进行目的序列选择引物，进行目的 DNA 扩增，然后用扩增，然后用15琼脂糖电泳法检出特异性琼脂糖电泳法检出特异性DNA带。带。第26页/共103页(3)分离培养分离培养 接种小鼠分离病原。将标本接种腹腔接种小鼠分离病原。将标本接种腹腔O5ml，一般多在一般多在718天死亡，感染小天死亡，感染小鼠有明显症状，濒死
25、前解剖，可见皮下淋鼠有明显症状，濒死前解剖，可见皮下淋巴结肿大充血，脾肿大，有粘稠的腹腔渗巴结肿大充血，脾肿大，有粘稠的腹腔渗出液，以出液，以Giemsa染色镜检，在靠近细胞核染色镜检，在靠近细胞核旁边可见成堆排列的立克次体。也可接种旁边可见成堆排列的立克次体。也可接种Vero细胞、细胞、L929细胞进行立克次体分离培细胞进行立克次体分离培养。细胞培养养。细胞培养1015天，取细胞涂片，天，取细胞涂片，Giemsa染色镜检。染色镜检。第27页/共103页(4)抗体检测抗体检测n外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗体体OXk效价达效价达l：160以上有意义，病
26、程中双以上有意义，病程中双份或多份血清试验，若效价有份或多份血清试验，若效价有4倍增高，有倍增高，有诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫病的诊断方法。病的诊断方法。第28页/共103页n免疫荧光试验：快速敏感特异，可分别检免疫荧光试验：快速敏感特异，可分别检测患者血清中的抗恙虫病立克次体测患者血清中的抗恙虫病立克次体lgG、IgM抗体，效价在抗体，效价在1：80以上有诊断意义。以上有诊断意义。双份血清有双份血清有4倍或以上增长可以确诊。倍或以上增长可以确诊。第29页/共103页四、贝纳柯
27、克斯体四、贝纳柯克斯体n又称又称Q Q热立克次体，是引起热立克次体，是引起Q Q热热(疑问热，指最疑问热，指最初不明病因的发热初不明病因的发热)的病原体。的病原体。n传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。nQ Q热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎和肝炎为其临床特征。和肝炎为其临床特征。n慢性慢性Q Q热主要表现为心内膜炎。热主要表现为心内膜炎。第30页/共103
28、页（一）微生物特性（一）微生物特性1.形态与结构形态与结构 个体较小，多为短杆状，常排列个体较小，多为短杆状，常排列成对，成对，Gimenez法染色呈红色，背景呈绿色，法染色呈红色，背景呈绿色，用用Giemsa法染色呈紫红色。有荚膜，在鸡胚法染色呈紫红色。有荚膜，在鸡胚卵黄囊或细胞培养内均可有芽胞形成。卵黄囊或细胞培养内均可有芽胞形成。2.基因组与抗原成分基因组与抗原成分 基因组分子量为大肠杆菌基因组分子量为大肠杆菌的的13；编码代谢酶、表面抗原与毒力因子；编码代谢酶、表面抗原与毒力因子有关基因。有两相抗原，有关基因。有两相抗原，相为光滑型相为光滑型LPS，相为粗糙型短链相为粗糙型短链LPS。
29、第31页/共103页3培养特点培养特点鸡胚是培养的极好宿主。一般经培养鸡胚是培养的极好宿主。一般经培养1012d，1g卵黄囊膜常可获得约卵黄囊膜常可获得约1000g纯净纯净的立克次体能在多种人和动物的原代或传的立克次体能在多种人和动物的原代或传代细胞内繁殖。一般不引起明显的细胞病代细胞内繁殖。一般不引起明显的细胞病变。变。第32页/共103页4抵抗力抵抗力n贝纳柯克斯体抵抗力强，贝纳柯克斯体抵抗力强，70-90加热加热3060min尚难杀死。尚难杀死。n1%福尔马林作用福尔马林作用24小时也不能完全灭活。小时也不能完全灭活。对氯霉素和四环素类抗生素敏感。对氯霉素和四环素类抗生素敏感。第33页/
30、共103页(二二)微生物检验微生物检验(1)标本直接抗原检测：免疫荧光法进行检测。标本直接抗原检测：免疫荧光法进行检测。(2)标本直接核酸检查：按标本直接核酸检查：按16SrRNA非保守区非保守区序列合成寡核苷酸探针，能检出序列合成寡核苷酸探针，能检出5pgrRNA，如将非保守区特异性扩增，其敏感性可达如将非保守区特异性扩增，其敏感性可达检出检出110个贝纳柯克斯体的水平。个贝纳柯克斯体的水平。用贝纳柯克斯休质粒用贝纳柯克斯休质粒DNA片段制备的探针，片段制备的探针，不仅能快速检出病原体，且能鉴别含不仅能快速检出病原体，且能鉴别含QpHI或或QpRS质粒分离株质粒分离株，与呼吸道感染病原体与呼
31、吸道感染病原体DNA无交叉反应。试验仅需无交叉反应。试验仅需812h即可得即可得到结果。到结果。第34页/共103页3分离培养分离培养n病原体分离只是在该地区尚未证明有病原体分离只是在该地区尚未证明有Q热存在，病情特别严重有必要。将标本热存在，病情特别严重有必要。将标本接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与否或生长情况，经形态学、血清免疫学否或生长情况，经形态学、血清免疫学等鉴定后作出结论等鉴定后作出结论。第35页/共103页4抗体检测抗体检测 用间接免疫荧光试验、用间接免疫荧光试验、ELISA和和CF试验。试验。CF试验中抗原相的选择对结果影响极大，对试验中抗原
32、相的选择对结果影响极大，对现症诊断主要看现症诊断主要看相抗体逐渐上升，若相抗体逐渐上升，若相相抗体保持较高水平，则往往说明慢性感染或抗体保持较高水平，则往往说明慢性感染或隐性感染。隐性感染。第36页/共103页五、埃立克体五、埃立克体(一一)临床意义为埃立克体病病原体。临床意义为埃立克体病病原体。1.人腺热埃立克体病人腺热埃立克体病 可能由蜱传播，也可能由蜱传播，也 可能由于摄食生鱼引起。临床表现为发可能由于摄食生鱼引起。临床表现为发 热头痛、淋巴细胞数增加，并出现非典热头痛、淋巴细胞数增加，并出现非典 型淋巴细胞。型淋巴细胞。2.人单核细胞埃立克体人单核细胞埃立克体(HME)病，主要侵病，主
33、要侵 染人的单核细胞和巨噬细胞。传播媒介染人的单核细胞和巨噬细胞。传播媒介 为蜱。为蜱。第37页/共103页3人粒细胞埃立克体人粒细胞埃立克体(HGE)病病 主要侵犯人主要侵犯人 粒细胞。硬蜱是传播媒介。也是莱姆病粒细胞。硬蜱是传播媒介。也是莱姆病 病原体的携带和传播者，故与莱姆病的病原体的携带和传播者，故与莱姆病的 相重叠。相重叠。第38页/共103页（二）微生物特性二）微生物特性1为为G-小球菌，呈多形性，小球菌，呈多形性，Romanows染染 色呈兰色和紫色。吞噬细胞以内吞的方色呈兰色和紫色。吞噬细胞以内吞的方 式将埃立克体摄入胞内，在胞质内以二式将埃立克体摄入胞内，在胞质内以二 分裂的
34、方式繁殖，形成包涵体。称为桑分裂的方式繁殖，形成包涵体。称为桑 椹体。椹体。第39页/共103页2基因组基因组 埃立克体的埃立克体的16SrRNA基因极保守，基因极保守，但但5端的端的50100碱基为高变区，适合设碱基为高变区，适合设计计 PCR引物或核酸杂交探针。人粒细胞埃立引物或核酸杂交探针。人粒细胞埃立 克体的外膜蛋白克体的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆，可用蛋白被克隆，可用 作探针。作探针。3抗原成分抗原成分 在埃立克体属内的各种埃立克在埃立克体属内的各种埃立克 体均可有血清学交叉反应。体均可有血清学交叉反应。第40页/共103页(三三)微生物检验微生物检验 1.标本直接显微镜检查标本直
35、接显微镜检查 采集病人的外周血制备血片，经采集病人的外周血制备血片，经Giemsa或或Wright染色，在光镜下发现粒细胞及染色，在光镜下发现粒细胞及单核细胞质或血小板内有圆形、深紫色单核细胞质或血小板内有圆形、深紫色的桑椹体，可作为急性期埃立克体病的的桑椹体，可作为急性期埃立克体病的一种简便和有效的辅助诊断方法。一种简便和有效的辅助诊断方法。第41页/共103页2.核酸检测核酸检测 PCR是最有效的埃立克体病的病原学诊断方是最有效的埃立克体病的病原学诊断方法，可用于埃立克体病的早期诊断。大约法，可用于埃立克体病的早期诊断。大约80-87HME和和43-75的的HGE患者的血标患者的血标本被本
36、被PCR检测为阳性。检测为阳性。特异性几乎为特异性几乎为100，主要依赖引物的特异性。，主要依赖引物的特异性。可用可用16SrRNA基因设计引物或做基因探针。基因设计引物或做基因探针。有极高的敏感性，感染后数天就可检出阳性有极高的敏感性，感染后数天就可检出阳性结果。结果。第42页/共103页3.细胞培养细胞培养n查菲埃立克体可用犬巨噬细胞系查菲埃立克体可用犬巨噬细胞系(DH82)，腺腺热埃立克体用小鼠的巨噬细胞系热埃立克体用小鼠的巨噬细胞系(P388D1)，人粒细胞埃立克体则用人的粒细胞白血病细人粒细胞埃立克体则用人的粒细胞白血病细胞系胞系(HL-60)作它们的体外培养的宿主细胞。作它们的体外
37、培养的宿主细胞。n将将3ml抗凝血的白细胞层，接种细胞单层，置抗凝血的白细胞层，接种细胞单层，置 37的的5C02孵育箱中培养，每隔孵育箱中培养，每隔3-4天换一天换一次细胞维持液，并刮少许细胞涂片，用次细胞维持液，并刮少许细胞涂片，用Giemsa染色，在光镜下检查埃立克体包涵体。染色，在光镜下检查埃立克体包涵体。第43页/共103页4.小鼠接种小鼠接种 从蜱体内分离埃立克体让蜱叮咬小鼠和吸血。从蜱体内分离埃立克体让蜱叮咬小鼠和吸血。或将病人或动物的抗凝血的白细胞注入小鼠或将病人或动物的抗凝血的白细胞注入小鼠腹腔。观察小鼠发病。腹腔。观察小鼠发病。定时采小鼠血作涂片染色、定时采小鼠血作涂片染色
38、、IFA、PCR等证等证明小鼠被埃立克体感染，用腹腔液涂片染色明小鼠被埃立克体感染，用腹腔液涂片染色镜检包涵体。镜检包涵体。第44页/共103页5.抗体检测抗体检测(1)间接免疫荧光间接免疫荧光(1FA)：将感染血清作倍比稀释，加入抗原孔内，将感染血清作倍比稀释，加入抗原孔内，置湿盒置湿盒37孵育孵育lh；玻片冲洗后，用玻片冲洗后，用 Evans蓝作背景染色，然后每孔加一滴固蓝作背景染色，然后每孔加一滴固 定液，加盖玻片，在荧光显微镜下检查感定液，加盖玻片，在荧光显微镜下检查感 染细胞内的带荧光的包涵体，通常血清中染细胞内的带荧光的包涵体，通常血清中 抗体滴度抗体滴度 1：20为阳性。若获双份
39、血清效为阳性。若获双份血清效 价增高价增高4倍以上即可明确诊断。倍以上即可明确诊断。第45页/共103页(2)(2)免疫印迹免疫印迹 采用免疫印迹检测埃立克体病患者血清采用免疫印迹检测埃立克体病患者血清 中抗埃立克体主要抗原组分的抗体，可中抗埃立克体主要抗原组分的抗体，可 以改善血清学检测的特异性。经免疫印以改善血清学检测的特异性。经免疫印 迹分析发现迹分析发现HMEHME患者血清中含有抗查菲患者血清中含有抗查菲 埃立克体的埃立克体的4444kDakDa抗原组分的抗原组分的IgGIgG抗体。抗体。但不能用于埃立克体病的早期诊断。但不能用于埃立克体病的早期诊断。第46页/共103页六、汉赛巴通体
40、六、汉赛巴通体 n引起杆菌性血管瘤引起杆菌性血管瘤杆菌性紫癜杆菌性紫癜(BAP)和和猫抓病猫抓病(CSD)的病原体。常在免疫缺陷病的病原体。常在免疫缺陷病毒毒(HIV)感染者发生，也感染有免疫潜能感染者发生，也感染有免疫潜能的人群，与接触猫有关。为的人群，与接触猫有关。为G-营养要求营养要求苛刻的需氧杆菌，为兼性胞内寄生菌。苛刻的需氧杆菌，为兼性胞内寄生菌。第47页/共103页n猫抓病有与猫接触史，抓咬部位形成丘猫抓病有与猫接触史，抓咬部位形成丘疹脓疱，继而出现淋巴结肿大，约疹脓疱，继而出现淋巴结肿大，约10病例有肉芽肿性结膜炎、骨质溶解、肺病例有肉芽肿性结膜炎、骨质溶解、肺炎及中枢神经系统损
41、害等。炎及中枢神经系统损害等。第48页/共103页杆菌性血管瘤杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜杆菌性紫癜n常在免疫低下者发生。与猫抓伤咬伤有关，常在免疫低下者发生。与猫抓伤咬伤有关，主要表现为皮肤损害和内脏发生紫癜。在主要表现为皮肤损害和内脏发生紫癜。在病变处能发现杆菌状小体。开始皮肤出现病变处能发现杆菌状小体。开始皮肤出现红丘疹，偶有溃疡。皮下出现肉色结节。红丘疹，偶有溃疡。皮下出现肉色结节。n杆菌性血管瘤可发生在任何实质性器官，杆菌性血管瘤可发生在任何实质性器官，很难与分枝杆菌和真菌感染或恶性肿瘤鉴很难与分枝杆菌和真菌感染或恶性肿瘤鉴别。别。第49页/共103页(一一)微生物特性微生物特性1为为G
42、-弯曲的杆状小体，常呈多形性；初弯曲的杆状小体，常呈多形性；初 分离有菌毛，发现有噬菌体。分离有菌毛，发现有噬菌体。2培养特性培养特性 营养要求苛刻的需氧杆菌，用营养要求苛刻的需氧杆菌，用 含新鲜血的琼脂或脑心浸液于含新鲜血的琼脂或脑心浸液于355 C02环境下培养环境下培养25周才长出灰色凸起周才长出灰色凸起 并嵌入琼脂内的菌落。并嵌入琼脂内的菌落。第50页/共103页3基因组基因组 约为约为2005kb。已经测序的基因已经测序的基因 有有16SrRNA和和 glt A基因序列包括基因序列包括1293 核苷酸，始于核苷酸，始于ATG起始密码子，终于起始密码子，终于 两两TAA终止密码子。终止
43、密码子。第51页/共103页(二二)微生物检验微生物检验1.标本染色直接检查标本染色直接检查 活检病理标本和淋巴结活检用活检病理标本和淋巴结活检用Warthin-Starry染色能查见多形性菌体。染色能查见多形性菌体。2.核酸检测核酸检测 依依16S rRNA或或gltA基因设计引物，对临床标基因设计引物，对临床标 本作本作 PCR，其扩增产物经序列测定或用特异其扩增产物经序列测定或用特异 性性DNA探针鉴定，可直接作出病原诊断。探针鉴定，可直接作出病原诊断。第52页/共103页3.分离培养分离培养可将血液标本先经溶血和离心处理，待长出可将血液标本先经溶血和离心处理，待长出菌落后作生化反应，分
44、析其细胞脂肪酸和菌落后作生化反应，分析其细胞脂肪酸和16SrRNA序列等加以鉴定。于培养序列等加以鉴定。于培养1周仍不见生周仍不见生长，应继续培养至长，应继续培养至4周。周。第53页/共103页4.抗体检测抗体检测(1)IFA：双份血清滴度呈双份血清滴度呈4倍增长为阳性；单倍增长为阳性；单份份 血清滴度至少达血清滴度至少达1：64方可考虑诊断。方可考虑诊断。(2)ELISA：用用 17KD重组体抗原作重组体抗原作 ELISA检测检测 人血清抗体人血清抗体IgG，有助于诊断。有助于诊断。(3)免疫印迹试验：可显示免疫印迹试验：可显示 485kDa 蛋白质组蛋白质组 分，而非巴通体感染病人血清则不
45、能与此蛋分，而非巴通体感染病人血清则不能与此蛋 白组分反应，以此作为确证试验。白组分反应，以此作为确证试验。第54页/共103页第二节 衣 原 体 n是一类专性细胞内寄生、有独特发育周是一类专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生物。归属于广义的细菌范畴。物。归属于广义的细菌范畴。n衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。第55页/共103页一、沙眼衣原体一、沙眼衣原体n不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿
46、系统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。n近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视。学界的重视。n沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种（肿生物变种（LGV）和鼠生物变种等和鼠生物变种等3个生个生物变种。物变种。第56页/共103页引起杆菌性血管瘤杆菌性紫癜(BAP)和猫抓病(CSD)的病原体。(2)PCR：可检出20ng恙虫病立克次体DNA；一、斑疹伤寒立克次体一般培养4872h后可
47、在细胞内查到包涵体及原体和始体颗粒。又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现象。又称Q热立克次体，是引起Q热(疑问热，指最初不明病因的发热)的病原体。2)PCR：检测3种衣原体的MOMP基因序列是简便、微量、快速、敏感的检测力法。病原体分离只是在该地区尚未证明有Q热存在，病情特别严重有必要。于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，每个发育周期约需4872h。检测特异性的IgM和IgG抗体，有利于区别近原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核,是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；在琼脂凝胶上
48、产生一条340bp的核酸带；1发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发育周期。可能与冠心病和心肌梗塞有关1沙眼亚种沙眼亚种(1)沙眼：沙眼：通过眼通过眼-手手-眼途径直接或间接密切接触传眼途径直接或间接密切接触传 播。由播。由A、B、Ba和和C血清型引起。结膜引血清型引起。结膜引 起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕 及角膜血管翳，影响视力。及角膜血管翳，影响视力。第57页/共103页(2)(2)包涵体结膜炎：包涵体结膜炎：由由B B、BaBa、D D、DaDa等血清型引起。婴儿通过等血清型引起。婴儿通过 产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角产道感染，引起滤泡
49、性结膜炎，不出现角 膜血管翳。膜血管翳。(3)(3)泌尿生殖道感染：泌尿生殖道感染：由由D-KD-K血清型引起。在性接触传播引起的血清型引起。在性接触传播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（非淋菌性泌尿生殖道感染（50506060）。）。易发展为持续感染或无症状携带者。易发展为持续感染或无症状携带者。第58页/共103页2.2.性病淋巴肉芽肿亚种，由性病淋巴肉芽肿亚种，由L L血清型引起血清型引起性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。3.3.鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠生物变种为鼠间传播，
50、不侵犯人，与鼠肺炎有关。鼠肺炎有关。第59页/共103页微生物特性微生物特性1发育周期与形态染色发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发衣原体具有特殊的发育周期。原体是细胞外存在形式，卵圆形，育周期。原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核有胞壁和拟核,是发育成熟的衣原体，具有高是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；网状体或称始体，圆形，大形成网状体；网状体或称始体，圆形，二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，后浓缩形成原体，最后细胞破裂释
