1、离心分离技术离心分离技术第五章第五章固液分离：固液分离：第一选择为过滤，第二选择为离心分离第一选择为过滤，第二选择为离心分离。应用：应用：A A、难过滤的发酵液（、难过滤的发酵液（d d小、小、大、过滤大、过滤v v慢）、甚至不能过慢）、甚至不能过滤的悬浮液，及忌用助滤剂、或助滤剂无效的悬浮液；滤的悬浮液，及忌用助滤剂、或助滤剂无效的悬浮液；B B、其他难分离的固液分离；、其他难分离的固液分离；C C、互不相溶的液、互不相溶的液液分离，如液液萃取；液分离，如液液萃取；D D、不同密度固体或乳浊液的密度梯度分离，如超离心分离、不同密度固体或乳浊液的密度梯度分离，如超离心分离缺点：缺点：A A、分
2、离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物；、分离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物；B B、处理量小；、处理量小；C C、设备复杂，价格贵，分离成本高。、设备复杂，价格贵，分离成本高。离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。离心分离离心分离离心沉降离心沉降利用固液两相的相利用固液两相的相对密度差对密度差无孔转鼓或无孔转鼓或管子管子悬浮液悬浮液离心过滤离心过滤利用离心力并通过利用离心力并通过过滤介质过滤介质有孔转鼓有孔转鼓悬浮液悬浮液离心分离离心分离
3、和超离心和超离心利用不同溶质颗粒利用不同溶质颗粒在溶液各部分分布在溶液各部分分布的差异的差异无孔转鼓或无孔转鼓或管子管子不同相对不同相对密度液体密度液体5.1 离心沉降离心沉降 当悬浮液静止不动时，由于重力场的作用，较大的悬当悬浮液静止不动时，由于重力场的作用，较大的悬浮颗粒会逐渐沉降，颗粒越重下沉越快，反之会上浮。但浮颗粒会逐渐沉降，颗粒越重下沉越快，反之会上浮。但很小的颗粒不仅沉降速度慢，而且扩散现象严重，很难或很小的颗粒不仅沉降速度慢，而且扩散现象严重，很难或根本无法沉降。这样就需离心的方法产生出离心力场，使根本无法沉降。这样就需离心的方法产生出离心力场，使之产生沉降。之产生沉降。一、离
4、心沉降原理一、离心沉降原理1、离心力（、离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等）的大小等于离心加速度于离心加速度2X与颗粒质量与颗粒质量m的乘积，即：的乘积，即：其中其中是旋转角速度，以弧度是旋转角速度，以弧度/秒为单位；秒为单位；X是颗粒离开旋转是颗粒离开旋转中心的距离，以中心的距离，以cm为单位；为单位；m是质量，以克为单位。是质量，以克为单位。根据根据F Fr r（离心分离因素、离心力强度
5、）对离心机分类：（离心分离因素、离心力强度）对离心机分类：常速离心机常速离心机:F Fr r3000g3000g 中速离心机中速离心机:3000g3000g F Fr r 50000g50000g 高速离心机高速离心机:F Fr r 50000g50000g 超高速离心机超高速离心机:F Fr r=20000-1000000g=20000-1000000g同一样品在不同的离心机上离心力不同同一样品在不同的离心机上离心力不同2、相对离心力（、相对离心力（relative centrifugal force，RCF）常用常用“相对离心力相对离心力”或或“数字数字g”表示离心力，只要表示离心力，只要
6、RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。式中式中X为离心转子的半径距离，以为离心转子的半径距离，以cm为单位；为单位；g为地球重力为地球重力加速度（加速度（980cm/sec2）；）；n为转子每分钟的转数（为转子每分钟的转数（rpm）。）。在说明离心条件时，低在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的速离心通常以转子每分钟的转数表示（转数表示（r/min），如，如4000 rpm；而在高速离心时，特别而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用
7、相是在超速离心时，往往用相对离心力来表示，如对离心力来表示，如65000g。3、沉降系数（、沉降系数（sedimentation coefficient，s）根据根据1924年年Svedberg对沉降系数下的定义：对沉降系数下的定义：颗粒在单颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度位离心力场中粒子移动的速度。以。以Svedberg表示，简称表示，简称S。沉降系数沉降系数S与分子量与分子量M有对应关系：有对应关系：R气体常数；气体常数；T温度（温度（K）；）；S沉降系数（沉降系数（s）；）；D粒子粒子扩散系数；扩散系数；粒子的偏比容（粒子密度的倒数）；粒子的偏比容（粒子密度的倒数）；溶剂密度。溶剂密度
8、。4、沉降速度（、沉降速度（sedimentation velocity）沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离动的距离。式中式中r为球形粒子半径；为球形粒子半径；d为球形粒子直径；为球形粒子直径；为流体介质的粘度；为流体介质的粘度；P为为粒子的密度；粒子的密度；m为介质的密度。为介质的密度。从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加也增加。当当Pm，则，则S
9、0，粒子顺着离心方向沉降。，粒子顺着离心方向沉降。当当Pm，则，则S0，粒子到达某一位置后达到平衡。，粒子到达某一位置后达到平衡。当当Pm，则，则S0，粒子逆着离心方向上浮。，粒子逆着离心方向上浮。二、二、离心沉降设备离心沉降设备 离心机可分为离心机可分为工业用离心机工业用离心机和和实验用离心机实验用离心机。实验用离心机又分为实验用离心机又分为制备性离心机制备性离心机和和分析性离心机分析性离心机。制备性离心机制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大样品容量比较大;分析性离心机分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的一般都带有光学
10、系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯物质的纯度、形状和相对分子质量度、形状和相对分子质量等。分析性离心机都是超速离心机。等。分析性离心机都是超速离心机。瓶式离心机瓶式离心机管式离心机管式离心机多室式离心机多室式离心机碟式离心机碟式离心机螺旋卸料沉降离心机螺旋卸料沉降离心机离心沉降设备离心沉降设备1.瓶式离心机瓶式离心机外摆式外摆式 角式角式 固定式固定式 离心管离心管 离心管主要用塑料和不锈钢制成：离心管主要用
11、塑料和不锈钢制成：塑料离心管常用材料有聚乙烯（塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（），聚碳酸酯（PC），），聚丙烯（聚丙烯（PP）等，其中）等，其中PP管性能较好。管性能较好。塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：液。管盖有三种作用：防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。这点尤其重要。防止样品挥发。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。支持离心管，防止离心管变形。2.管式离心机管式离心机3.多室式离心机多室式离心机缺点：出渣比较困难。缺
12、点：出渣比较困难。适用于处理直径大于适用于处理直径大于0.1m的颗粒，固相浓度小于的颗粒，固相浓度小于5%的悬浮液，的悬浮液，常用于抗菌素液液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。常用于抗菌素液液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。转鼓内有数个同心圆筒组成的转鼓内有数个同心圆筒组成的环隙状分离室。各分离室的流道串环隙状分离室。各分离室的流道串联。操作时，悬浮液自中心进料管联。操作时，悬浮液自中心进料管加入转鼓中，由内向外顺序流经各加入转鼓中，由内向外顺序流经各分离室。在逐渐增大的离心力作用分离室。在逐渐增大的离心力作用下，悬浮液中的粗颗粒沉积在内部下，悬浮液中的粗颗粒沉积在内部的分离室壁上，细颗粒沉
13、积在外部的分离室壁上，细颗粒沉积在外部的分离室壁上。的分离室壁上。4.碟片式离心机碟片式离心机 碟式离心机是立式离碟式离心机是立式离心机的一种，转鼓装在心机的一种，转鼓装在立轴上端，通过传动装立轴上端，通过传动装置由置由电动机驱动电动机驱动而高速而高速旋转。旋转。转鼓内有一组锥顶角为转鼓内有一组锥顶角为60100度的的互相套叠在一起的度的的互相套叠在一起的碟形零件碟形零件-碟片碟片。碟片与碟片间的距离用附于碟片背面的具有。碟片与碟片间的距离用附于碟片背面的具有一定厚度的狭条来控制，碟片的距离为一定厚度的狭条来控制，碟片的距离为.52.5mm。当转鼓连同碟片以高速旋转时，碟当转鼓连同碟片以高速旋
14、转时，碟片间的悬浮液中的固体颗粒因其有较大片间的悬浮液中的固体颗粒因其有较大的质量，优先沉降于碟片的内腹面，并的质量，优先沉降于碟片的内腹面，并连续向鼓壁方面沉降，澄清的液体则被连续向鼓壁方面沉降，澄清的液体则被迫反方向移动而在转颈部进液管周围的迫反方向移动而在转颈部进液管周围的排液口排出。排液口排出。沉渣沿碟片表面滑动而脱沉渣沿碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在离碟片并积聚在转鼓内直径最大的部位转鼓内直径最大的部位，分离后的液体从出液口分离后的液体从出液口排出转鼓排出转鼓。.碟片的结构是：碟片的结构是：1.1.碟片用薄的不锈钢冲成；碟片用薄的不锈钢冲成；2.2.碟片呈圆台形；碟片呈圆台形；3.3
15、.在碟片上开有对称的孔。在碟片上开有对称的孔。碟式分离机转鼓内有一组碟片，把转鼓空间分成碟式分离机转鼓内有一组碟片，把转鼓空间分成许多薄层分离空间，从而大大缩短沉降距离，改善和许多薄层分离空间，从而大大缩短沉降距离，改善和提高分离效果。提高分离效果。任何处于两碟片之间的极限颗粒若能在此路程段任何处于两碟片之间的极限颗粒若能在此路程段中到达碟片内表面，则可以被分离出来。中到达碟片内表面，则可以被分离出来。卸渣方式卸渣方式 a.a.人工排渣的碟片离心机人工排渣的碟片离心机 b.b.喷嘴排渣碟片式离心机喷嘴排渣碟片式离心机 c.c.活门排渣碟片式离心机活门排渣碟片式离心机 d.d.活门排渣的喷嘴碟片
16、式离心机活门排渣的喷嘴碟片式离心机 卧式螺旋卸料沉降离心机是利用卧式螺旋卸料沉降离心机是利用离心沉降原理离心沉降原理分离悬浮液分离悬浮液的设备，它主要用于完成的设备，它主要用于完成固液相有密度差固液相有密度差的悬浮液的固相的悬浮液的固相脱水，液相澄清，粒度分级，浓缩等工艺过程。脱水，液相澄清，粒度分级，浓缩等工艺过程。5.螺旋卸料沉降离心机螺旋卸料沉降离心机 原理：转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转，物料由进料管原理：转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转，物料由进料管连续引入输料螺旋内筒，加速后进入转鼓，在离心力场作用下，连续引入输料螺旋内筒，加速后进入转鼓，在离心力场作用下，较重的固相物沉积在转鼓
17、壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的较重的固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，较轻的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，较轻的液相物则形成内层液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经液相物则形成内层液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经排液口排出机外。排液口排出机外。5-2 离心过滤离心过滤一、离心过滤的原理离心过滤的原理 离心过滤是将料液送入有离心过滤是将料液送入有孔的转鼓并利用离心力场进行孔的转鼓并利用离心力场进行过滤的过程，以离心力为推动过滤的过程，以离心力为推动力完成过滤。力完成过滤。兼有离心和过滤兼有离心和过滤的双重作
18、用的双重作用。滤饼滤饼离心过滤机工作原理图离心过滤机工作原理图滤网滤网 以以间歇离心过滤间歇离心过滤为例，料液首先进入装有过滤介质为例，料液首先进入装有过滤介质(滤滤网或有孔套筒网或有孔套筒)的转鼓中，然后被加速到转鼓旋转速度，形的转鼓中，然后被加速到转鼓旋转速度，形成附着在鼓壁上的液环。与沉降式离心机一样，粒子受离成附着在鼓壁上的液环。与沉降式离心机一样，粒子受离心力而沉积，过滤介质则阻止粒子的通过，形成滤饼。当心力而沉积，过滤介质则阻止粒子的通过，形成滤饼。当悬浮液的固体粒子沉积时，滤饼表面生成了澄清液，该澄悬浮液的固体粒子沉积时，滤饼表面生成了澄清液，该澄清液透过滤饼层和过滤介质向外排出
19、。清液透过滤饼层和过滤介质向外排出。分批立式轴分批立式轴分批卧式轴分批卧式轴二、离心过滤设备二、离心过滤设备 间歇式间歇式连续推送式连续推送式连续锥形滤网连续锥形滤网连续式连续式 GT6H13 卧式离心过滤机卧式离心过滤机 本机适宜过滤果汁或皮汁，本机适宜过滤果汁或皮汁，达到液达到液固体分离，提高汁的纯度。固体分离，提高汁的纯度。自动连续卸料离心过滤机为自动连续卸料离心过滤机为 (锥形转鼓锥形转鼓)基本参数基本参数 选择选择颗粒d,固液差,基本型号 固体物浓度 亚型产物热稳定性 低温离心流量Q,规模 规格、台数气溶胶,活cell 密封灭菌设计5.3 离心机的选用离心机的选用（P66）包含体产物
20、分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）5.4 离心机在生物工业中的应用离心机在生物工业中的应用（P67）5.5 超离心法超离心法超离心法超离心法：根据物质的根据物质的沉降系数沉降系数、质量质量和和形状形状不同，应用不同，应用强大的离心力强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法。纯的方法。一、一、超离心技术的原理超离心技术的原理 在某种介质中，使一种球形粒子从液体的弯月面在某种介质中，使一种球形粒子从液体的弯月面沉降到离心管某部沉降到离心管某部(如底部如底部)所需的时间：所需的时间：当粒子当粒子直径和密度直径和密度不同不
21、同,移动同样距离所需的时间不移动同样距离所需的时间不同同,在同样的沉降时间在同样的沉降时间,其沉降位置也不同其沉降位置也不同.式中式中t为沉降时间，为沉降时间，为悬浮介质的粘度，为悬浮介质的粘度，d为粒子直径，为粒子直径，s为粒子密为粒子密度，度，为介质密度；为介质密度；r1为旋转轴中心到液体弯月面的距离，为旋转轴中心到液体弯月面的距离，r2为从旋转为从旋转轴中心到离心管底部的距离。轴中心到离心管底部的距离。利用它可以利用它可以从组织匀浆中分离细胞器从组织匀浆中分离细胞器，其主要细胞成，其主要细胞成分的沉降顺序，分的沉降顺序，一般先是整细胞和细胞碎片，然后是核、一般先是整细胞和细胞碎片，然后是
22、核、叶绿体、线粒体、溶酶体、微粒体和核蛋白体叶绿体、线粒体、溶酶体、微粒体和核蛋白体。二、超离心技术的分类二、超离心技术的分类差速离心差速离心（一）制备性超离心（一）制备性超离心（二）分析性超离心（二）分析性超离心等密度离心等密度离心一般密度梯度离心法一般密度梯度离心法密度梯度离心密度梯度离心 采用不同的离心速度和离心时间，使采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同沉降速度不同的颗的颗粒在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。粒在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。（一）制备性超离心（一）制备性超
23、离心1、差速离心、差速离心(Differential centrifugation)：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。分开，并可使用容量较大的角式转子。：分离效果差；分离效果差；壁效应严重；壁效应严重；颗粒被挤压。颗粒被挤压。2、密度梯度区带离心法、密度梯度区带离心法 密度区带离心法密度区带离心法是样品在一定是样品在一定惰性梯度介质惰性梯度介质中进行离心沉中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，位置上，形成不同区带形成不同
24、区带的分离方法。的分离方法。密度梯度系统：密度梯度系统：梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活。引起分离组分的凝集、变性或失活。样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干条界面清样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干条界面清楚的不连续区带。楚的不连续区带。优点优点：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防
25、止颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。已形成的区带由于对流而引起混合。缺点缺点：离心时间较长；离心时间较长；需要制备梯度；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。操作严格，不宜掌握。（1）一般密度梯度离心法）一般密度梯度离心法 差速区带离心法（动态法或沉降速度法）差速区带离心法（动态法或沉降速度法）（Diensity gradient centrifugation）根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区
26、带，达到彼此分离的目的。到彼此分离的目的。离心过程中区带的位置、形状随离心时间而改变离心过程中区带的位置、形状随离心时间而改变用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与密度无关用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与密度无关 把样品铺放在一个把样品铺放在一个连续的液体密度梯度连续的液体密度梯度上，然后进行离心，上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前沉降之前，在液体梯，在液体梯度中移动而形成不连续分离区带。该法仅用于分离有一定度中移动而形成不连续分离区带。该法仅用于分离有一定沉沉降系数差降系数差的粒子，的粒子，与粒子密度无关与粒子密度无关。因此大小相同，
27、密度不。因此大小相同，密度不同的粒子同的粒子(如线粒体、溶酶体和过氧物酶体如线粒体、溶酶体和过氧物酶体)不能用此法分离。不能用此法分离。这种方法已用于这种方法已用于RNADNA混合物、核蛋白体亚单位和其他混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离。细胞成分的分离。（2）等密度离心）等密度离心（Isopycnic centrifugation）指当不同颗粒存在指当不同颗粒存在浮力密度差浮力密度差时，在离心力作用时，在离心力作用下，颗粒或下，颗粒或向下沉降向下沉降或或向上浮起向上浮起，一直沿梯度移动到与，一直沿梯度移动到与其密度恰好相等的位置上（即等密度点），形成区带而其密度恰好相等的位置上（即等
28、密度点），形成区带而分离的方法。分离的方法。处于等密度点的颗粒没有重量，处于等密度点的颗粒没有重量，区带的位置、形状均不受离区带的位置、形状均不受离心时间的影响心时间的影响，体系处于动态平衡。，体系处于动态平衡。差速区带离心法和等密度离心法的区别差速区带离心法和等密度离心法的区别差速区带离心法差速区带离心法等密度离心法等密度离心法原理原理依据粒子的沉降速率差异依据粒子的沉降速率差异被分离被分离依据粒子本身的密度差异依据粒子本身的密度差异被分离被分离梯度梯度范围范围介质的密度小于样品中各介质的密度小于样品中各种粒子的密度种粒子的密度介质的密度大于待分离样介质的密度大于待分离样品中各种粒子的密度品
29、中各种粒子的密度时间时间效应效应长时间离心，所有待分离长时间离心，所有待分离粒子都沉降在管底粒子都沉降在管底长时间离心，各粒子停留长时间离心，各粒子停留在等密度位置形成区带在等密度位置形成区带等密度离心等密度离心差速区带离心差速区带离心（二）分析性超离心（二）分析性超离心 分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。中的沉降过程。相对分
30、子质量的测定（纹影光学、吸收扫描光学系统）相对分子质量的测定（纹影光学、吸收扫描光学系统）大分子纯度的估计大分子纯度的估计检测大分子中构相的变化检测大分子中构相的变化与制备用机型的不同点与制备用机型的不同点：1由于盛液器（离心由于盛液器（离心池）有池）有“光学窗口光学窗口”，故受材料强度限制，允故受材料强度限制，允许转速略低，在许转速略低，在80000rpm以内使用。以内使用。2转速与温度直接影转速与温度直接影响测定数据，必须控制响测定数据，必须控制很严：转速偏差很严：转速偏差1.5，温差温差0.1 3附有动态光学检测，附有动态光学检测，数据分析系统。数据分析系统。三、密度梯度技术三、密度梯度
31、技术 步骤：步骤：A.形成密度梯度形成密度梯度 B.加样加样 C.离心离心 D.收集样品收集样品（一）密度梯度的作用（一）密度梯度的作用:1、增加分离层次，提高分辨率。、增加分离层次，提高分辨率。2、防止温差及振动造成的影响。、防止温差及振动造成的影响。（二）对密度梯度的基本要求：（二）对密度梯度的基本要求：1、梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度。作出密度范围大的密度梯度。2、理化性质稳定，生物惰性；离子强度低，渗透压小，理化性质稳定，生物惰性；离子强度低，渗透压小，粘度小。粘度小。3、具某种可测性（如折射率）以测其
32、浓度（密度），具某种可测性（如折射率）以测其浓度（密度），但不干扰分离组分的测定。但不干扰分离组分的测定。4、便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。、便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。(三三)密度梯度的设计密度梯度的设计1.1.梯度介质的选用梯度介质的选用:(1)(1)盐梯度介质盐梯度介质 (2)(2)小分子有机物如蔗糖小分子有机物如蔗糖 (3)(3)三碘化苯衍生物三碘化苯衍生物 (4)(4)有机高聚物有机高聚物 (5)(5)胶态二氧化硅胶态二氧化硅蔗糖：蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达达1.33g/ml，且由于价格低
33、容易制备，是现在实验室里，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常常用于细胞器、病毒、用于细胞器、病毒、RNA分离分离的梯度材料，但由于的梯度材料，但由于有较大有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离的渗透压，不宜用于细胞的分离。聚蔗糖：聚蔗糖：商品名商品名Ficoll，常采用，常采用Ficoll-400也就是相对分子也就是相对分子重量为重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞种细胞包括血细胞、成纤维细胞、
34、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。等。氯化铯：氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地较好的分辨率，被广泛地用于用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白、质粒、病毒和脂蛋白的分离的分离，但，但价格较贵价格较贵。常见的密度梯度材料及应用常见的密度梯度材料及应用卤化盐类：卤化盐类：KBr和和NaCl可用于脂蛋白分离，可用于脂蛋白分离，KI和和NaI可用可用于于RNA分离其高于铯盐。分离其高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，梯度也可用于分离脂蛋白，
35、NaI梯度可分离天然或变性的梯度可分离天然或变性的DNA。Percoll：是商品名，它是一种是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。于细胞、细胞器和病毒的分离。2 2、梯度的密度范围：、梯度的密度范围：差速区带离心：差速区带离心：最大密度最大密度 组份最小密度组份
36、最小密度 等密度区带离心：等密度区带离心：最小密度最小密度 组份最大密度组份最大密度 盐介质离心形成的梯度范围与介质性质、起始浓度、盐介质离心形成的梯度范围与介质性质、起始浓度、离心力大小、两端旋转半径有关。离心力大小、两端旋转半径有关。线性梯度线性梯度阶梯型阶梯型对数型对数型指数型指数型u线形梯度线形梯度：最常用：最常用u阶梯梯度：阶梯梯度：梯度容量大，梯度容量大，分离快，分离快，主要用于颗粒区带主要用于颗粒区带很靠近时的等密度区带离心。很靠近时的等密度区带离心。适用于亚细胞器、整细胞和适用于亚细胞器、整细胞和病毒。病毒。u凹形梯度（对数型）：凹形梯度（对数型）：常常用等密度区带离心时，提高
37、用等密度区带离心时，提高较低密度颗粒组分的分辨率。较低密度颗粒组分的分辨率。u凸形梯度（指数型）：凸形梯度（指数型）：常用等密度区带离常用等密度区带离心时，提高较高密度颗粒组分的分辨率。心时，提高较高密度颗粒组分的分辨率。u复合型梯度：复合型梯度：包含上述包含上述一个以上的梯度形状，一一个以上的梯度形状，一次离心即可彻底分离样品次离心即可彻底分离样品组分。组分。3 3、梯度的形状、梯度的形状4 4、梯度的容量：、梯度的容量：指在达到分离要求前提下，梯度介质容纳样品的最大数指在达到分离要求前提下，梯度介质容纳样品的最大数量。量。o 与样品组成，分离要求有关；与样品组成，分离要求有关；o 与梯度总
38、体积、斜率、介质粘度有关；与梯度总体积、斜率、介质粘度有关；o 与转速、转子形式有关；与转速、转子形式有关；o 差速区带离心时，与样品体积、浓度有关。差速区带离心时，与样品体积、浓度有关。5 5、密度梯度的制备、密度梯度的制备（手工、梯度混合仪、离心形成法）（手工、梯度混合仪、离心形成法）预形成梯度：预形成梯度：手工法、梯度混合仪法手工法、梯度混合仪法 此方法要事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是此方法要事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物非离子型的化合物(如蔗糖、甘油等如蔗糖、甘油等)。离心时把样品铺放。离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度在
39、梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，范围，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。发生沉降，并排列成不同的区带。用这一技术可以定量的从线粒体和过氧化物酶体中分离溶酶体。用这一技术可以定量的从线粒体和过氧化物酶体中分离溶酶体。(1)(1)阶梯梯度：阶梯梯度：用手工由底部向上分层加入渐浓的介质溶液，由于扩散用手工由底部向上分层加入渐浓的介质溶液，由于扩散作用可自然形成连续梯度。扩散时间还受温度、阶梯厚度、作用可自然形成连续梯度。扩散时间还受温度、阶梯厚度、阶梯密度差的影响。阶梯密度差的影响。(2)(2)
40、混合梯度法：混合梯度法：借助梯度混合仪或自动梯度仪，可自动调节梯度斜率、借助梯度混合仪或自动梯度仪，可自动调节梯度斜率、形状、浓度，还可同时制备几个梯度。制成的梯度放置过久，形状、浓度，还可同时制备几个梯度。制成的梯度放置过久，梯度形状、斜率会变化。梯度形状、斜率会变化。梯度混合器梯度混合器三种梯度形成示意图三种梯度形成示意图a凸形梯度凸形梯度b线性梯度线性梯度 c 凹形梯度凹形梯度High density solutionLow density solution自形成梯度自形成梯度：（：（3）离心平衡法离心平衡法 自形成梯度的等密度离心自形成梯度的等密度离心(平衡等密度离心平衡等密度离心)。
41、平衡等密。平衡等密度离心常用的梯度介质有离子型度离心常用的梯度介质有离子型盐类如铅盐或铷盐和三碘化盐类如铅盐或铷盐和三碘化苯衍生物等苯衍生物等。离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后。离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分再分配。离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。四、离心操作四、离心操作 (一一)加样和离心：加样和离心：1.1.样品准备样品
42、准备：离心前先除去样品中大颗粒和胶状不溶物。离心前先除去样品中大颗粒和胶状不溶物。要求样液密度要求样液密度 梯度最大值（速度区带离心）。梯度最大值（速度区带离心）。o 样液中含有低浓度盐（如样液中含有低浓度盐（如0.2M NaCl0.2M NaCl）可消除组分颗粒间）可消除组分颗粒间电荷影响（减慢速度降低分辨率）。电荷影响（减慢速度降低分辨率）。o 样品中需加缓冲剂或保护剂，如酶底物、样品中需加缓冲剂或保护剂，如酶底物、EDTAEDTA等或等或CaCa2+2+、MgMg2+2+离子。离子。2.2.加样加样：顶部加样顶部加样沉降差速区带离心；沉降差速区带离心；底部加样底部加样漂浮差速区带离心；漂
43、浮差速区带离心；中部加样中部加样平衡等密度离心（等密度区带离心）；平衡等密度离心（等密度区带离心）；混合加样混合加样平衡等密度离心；平衡等密度离心；差速区带离心：样品须少（差速区带离心：样品须少（5%5%梯度总体积），样品不太梯度总体积），样品不太浓（浓（90%90%梯度最小浓度）。梯度最小浓度）。严格按使用说明操作。严格按使用说明操作。样品管要充满且配平；样品管要充满且配平；超离心须在低温、真空下进行；超离心须在低温、真空下进行；加速、减速须缓慢；加速、减速须缓慢；防止扰动梯度和区带，降低分辨率；防止扰动梯度和区带，降低分辨率；平衡等密度离心时，转速不能过高。平衡等密度离心时，转速不能过高。
44、3.3.离心离心：(二二)梯度的回收梯度的回收1.1.底部收集法（穿刺法）：底部收集法（穿刺法）：用一根金属空心针从离心管底刺用一根金属空心针从离心管底刺人管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流人管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。从高密度开始收集。出，然后用部分收集器分别收集。从高密度开始收集。2.2.顶部收集法：顶部收集法：不破坏离心管。不破坏离心管。o取代法：取代法：o 向上取代法：注入高密度液体；向上取代法：注入高密度液体；o 向下取代法：注入低密度液体。向下取代法：注入低密度液体。o虹吸法：靠负压依次吸取梯度液。虹吸法：靠负压依
45、次吸取梯度液。3.3.切割法：切割法：粘度大时上述方法不适用。粘度大时上述方法不适用。冻结切割法；冻结切割法；聚合切割法。聚合切割法。(三）梯度分析三）梯度分析:测定梯度浓度意义测定梯度浓度意义 梯度测定法梯度测定法 样品测定样品测定（四）离心制备的步骤（四）离心制备的步骤:组织组织-匀浆匀浆-过滤过滤-分级离心分级离心-梯度离心梯度离心（五）制备超离心注意事项（五）制备超离心注意事项:注意平衡注意平衡 查阅目的物信息查阅目的物信息超离心设备超离心设备美国美国BECKMAN（J6系列）系列）超高速离心机超高速离心机离心操作的注意事项离心操作的注意事项 高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的
46、高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。超速冷冻离心机超速冷冻离心机:未经过培训和考核者不能使用。未经过培训和考核者不能使用。其它普通离心机：按照操作要求进行。其它普通离心机：按照操作要求进行。1.1.使用各种离心机时，必须事先在天平上使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡精密地平衡离心管和其内容物离心管和其内容物，平衡时
47、重量之差不得超过各个离心机，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是，当转头只是部分装载时，部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中管子必须互相对称地放在转头中，以便使负，以便使负载均匀地分布在转头的周围。载均匀地分布在转头的周围。2.2.离心前必须仔细检查转头各离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物孔内有无异物。3.3.若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱
48、或置于离心机的转头室内放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷预冷。4.装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离制备性超速离心机的离心管心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转
49、头，及管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。的离心管。5.5.离心过程中离心过程中不得随意离开不得随意离开，应随时观察离心机上，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。及时排除故障。6.6.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用不得过速使用。每一转头都。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。7.7.离心时不准开盖，不准用手停止转头。离心时不准开盖，不准用手停止转头。
