1、分子生物学与临床 中中 山山 大大 学学 主讲：杨主讲：杨 中中 汉汉（yangzhonghan163yangzhonghan163）karymullis PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要20kB fragments插入噬菌体载体细菌扩增从基因组文库中筛选目的基因从基因组文库中筛选目的基因probe引物引物1977年引物引物引物引物1983年XX()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 复温 3 PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链
2、。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。30次 12341234A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失 PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？（固定
3、化PCR）锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作 A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增荧光标记荧光标记 I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission Taqman探针3端Q荧光分子能够吸收5端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5端荧光分子发出的荧光,只能检测到3端荧光分子的荧
4、光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板)时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5外切酶活性,将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)Oligo 1:FluoresceinOligo 2:LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量传递（FRET
5、 Probe）RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）引物特异性探针（引物特异性探针（Amplisenor Probe）535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针（引物特异性探针（Amplifluor Probe）全新全新4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪+55A正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)APCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交探针杂交NC膜探针 HLA系统基因分型 （序列特异性引物-PCR技术）数目可变的串联重复序列）现 嫌1 嫌2 嫌3
