1、 凝集试验凝集试验沉淀试验沉淀试验补体参与的补体参与的试验试验标记抗体技术标记抗体技术中和试验中和试验直接凝集试验直接凝集试验间接凝集试验间接凝集试验SPA协同凝集试验协同凝集试验桥梁凝集试验桥梁凝集试验絮状沉淀试验絮状沉淀试验琼脂扩散试验琼脂扩散试验免疫电泳免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳补体结合试验补体结合试验免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术免疫酶技术免疫酶技术同位素标记技术同位素标记技术中和试验中和试验 用用 途途定性定性 定量定量 定位定位种种 类类+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-l种类：种类：1.1.凝集试验凝集试验 细菌和红细胞等颗粒性抗原，细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相
2、应抗体特异结合后，在适量电解质存在当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下可逐渐凝集，出现肉眼可见的凝集现的条件下可逐渐凝集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应（直接凝集试验）象称为凝集反应（直接凝集试验）。l间接凝集试验间接凝集试验 将可溶性抗原或抗体结将可溶性抗原或抗体结合在一种与免疫无关的惰性微粒表面，合在一种与免疫无关的惰性微粒表面，然后与相应的抗体或抗原作用，在有电然后与相应的抗体或抗原作用，在有电解质存在的适宜条件下，微粒即可被动解质存在的适宜条件下，微粒即可被动的被凝集，出现肉眼可见的凝集现象。的被凝集，出现肉眼可见的凝集现象。通过微载体进行的凝集试验叫间接凝集通过微载体
3、进行的凝集试验叫间接凝集试验，也称微载体技术。试验，也称微载体技术。l常用的微载体：常用的微载体：致敏红细胞、聚苯乙烯致敏红细胞、聚苯乙烯乳胶、炭粉颗粒乳胶、炭粉颗粒 Ag+（红细胞、乳胶、炭）（红细胞、乳胶、炭）载体载体载体载体Ag Ag AgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAgAg间接凝集反应间接凝集反应AgAgl将抗原结合在微载体上进行的凝集试验叫将抗原结合在微载体上进行的凝集试验叫“正向间接正向间接凝集试验凝集试验”；将抗体结合在微载体上进行的凝集试验将抗体结合在微载体上进行的凝集试验叫叫“反向间接凝集试验反向间接凝集试验”。lSPASPA协同凝集试验协同凝集试验 葡萄球菌
4、葡萄球菌A A蛋白蛋白（staphylococalstaphylococal protein A,SPA)protein A,SPA)是葡是葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种动萄球菌的特异性表面抗原，能与多种动物物IgGIgG的的FcFc片段结合。特异性的片段结合。特异性的IgGIgG的的FcFc片段与片段与SPASPA结合后，其结合后，其FabFab片段仍保持与片段仍保持与特异性抗原结合的特点而发生抗原抗体特异性抗原结合的特点而发生抗原抗体反应，从而导致葡萄球菌的凝集。反应，从而导致葡萄球菌的凝集。桥梁凝集试验桥梁凝集试验 又称又称CoombsCoombs抗球蛋白试验，抗球蛋白试验，用于检测
5、不完全抗体。单价抗体只有一用于检测不完全抗体。单价抗体只有一个抗原结合部位，不会产生凝集反应，个抗原结合部位，不会产生凝集反应，当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各连结一个抗原决定簇的单价抗体再连结连结一个抗原决定簇的单价抗体再连结起来，出现凝集。起来，出现凝集。l2.2.沉淀试验沉淀试验 可溶性抗原与相应抗体结合所发生的可溶性抗原与相应抗体结合所发生的沉淀反应沉淀反应(precipitation)(precipitation)。如细菌、寄生虫的浸如细菌、寄生虫的浸出液、组织浸出液、培养滤液、动物血清等，与相出液、组织浸出液、培养滤液、动物血清等，与相应应AbA
6、b相遇后在有电解质存在下相遇后在有电解质存在下Ag-AbAg-Ab复合物相互交复合物相互交联形成免疫复合物达一定大时，可出现肉眼可见的联形成免疫复合物达一定大时，可出现肉眼可见的沉淀反应。沉淀反应。l沉淀抗原是细胞的浸出成分，为细微的胶体溶液，沉淀抗原是细胞的浸出成分，为细微的胶体溶液，单个抗原的体积小而总面积大，出现反应需要的抗单个抗原的体积小而总面积大，出现反应需要的抗体量多体量多 l 沉淀试验可分为沉淀试验可分为环状环状/絮状沉淀试验、琼脂扩散试絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳。验、免疫电泳。免疫电泳技术免疫电泳技术 将琼脂扩散试验与电泳技术结将琼脂扩散试验与电泳技术结合起来的一种免
7、疫检测技术。合起来的一种免疫检测技术。在在AgAg、AbAb在凝胶中扩散的同时加入电在凝胶中扩散的同时加入电场作用，使场作用，使AgAg、AbAb的扩散速度加快，同时限的扩散速度加快，同时限制了扩散的方向，增加了试验的敏感性。制了扩散的方向，增加了试验的敏感性。AgAb-+补体结合试验是补体结合试验是可溶性抗原与相应抗体结可溶性抗原与相应抗体结合后，可以再结合补体合后，可以再结合补体，但这一反应不能被肉，但这一反应不能被肉眼观察到，可加入红细胞及其抗体（溶血素），眼观察到，可加入红细胞及其抗体（溶血素），根据是否溶血来判定反应系统是否存在相应抗根据是否溶血来判定反应系统是否存在相应抗原抗体，如
8、红细胞不溶解说明存在相应的抗原原抗体，如红细胞不溶解说明存在相应的抗原抗体，为阳性反应；如溶血则说明不存在相应抗体，为阳性反应；如溶血则说明不存在相应的抗原抗体，为阴性反应。的抗原抗体，为阴性反应。l检测系统检测系统 Ag+Ab Ag-Ab Ag-Ab-补体补体 +补体补体 红细胞红细胞 +溶血素溶血素 红红-溶溶指示系统指示系统（不溶血，阳性）（不溶血，阳性）红红-溶溶-补体补体（溶血，阴性）（溶血，阴性）4.4.标记抗体技术标记抗体技术 标记抗体技术是在抗体球标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子的分子或原子 (标记物
9、标记物)，利用标记抗体能与，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。从而确定抗原的存在部位。标记抗体标记抗体技术技术 =抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性免疫标记技术的主要特点：免疫标记技术的主要特点：高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术+标记技术标记技术常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质 类别类别 标记物标记物 用途用途 荧光素荧光素 FITC、RB200等等 免疫组化免疫组化 免疫分析测定免疫分析测定 酶酶 HRP、AP 免疫组化免疫组化 免疫分析测定免疫分析测定
10、金属颗粒金属颗粒 胶体金、铁蛋白胶体金、铁蛋白 免疫组化免疫组化 免疫分析测定免疫分析测定 放射性核素放射性核素 3H、14C、32P、57Gr、125I、131I 免疫分析测定免疫分析测定 l4.1.14.1.1原理：原理：荧光素在紫外线照射下可发出肉荧光素在紫外线照射下可发出肉眼可见的荧光，其与抗体结合后仍保持其本身眼可见的荧光，其与抗体结合后仍保持其本身的特性。的特性。l荧光抗体与相应抗原结合后，（荧光抗体与相应抗原结合后，（1 1）通过荧光）通过荧光显微镜观察可测知抗原的存在及部位；显微镜观察可测知抗原的存在及部位；（2 2）依荧光强弱也可测知抗原量的差异。）依荧光强弱也可测知抗原量的
11、差异。4.1.2 荧光抗体的标记荧光抗体的标记l（）免疫球蛋白（）免疫球蛋白（IgGIgG）的提取：）的提取：硫酸铵盐析法、硫酸铵盐析法、DEAE-DEAE-纤维素提取法。纤维素提取法。l（）荧光抗体的标记：（）荧光抗体的标记：标记标记AbAb常用的荧光素有常用的荧光素有异硫氰酸异硫氰酸荧光素荧光素（FITCFITC，为黄色或橙黄色结晶粉末，最大吸收光波，为黄色或橙黄色结晶粉末，最大吸收光波长为长为490-495nm490-495nm，最大发射光波长，最大发射光波长520-530nm520-530nm，呈现明亮的，呈现明亮的黄绿色荧光黄绿色荧光）和）和四乙基罗丹明四乙基罗丹明（RB200RB2
12、00，为橘红色粉末，最，为橘红色粉末，最大吸收光波长为大吸收光波长为570nm570nm，最大发射光波长为，最大发射光波长为595595600nm600nm，呈，呈橘红色荧光橘红色荧光）。）。l FITCFITC的标记如下：的标记如下：l浓缩后的浓缩后的IgGIgG、定量、稀释（、定量、稀释（1020mg/ml1020mg/ml）.lFITCFITC按蛋白量的按蛋白量的1/801/801/1001/100加入。应用加入。应用pH9.5pH9.5的的0.5M0.5M碳酸盐缓冲液将碳酸盐缓冲液将FITCFITC进行溶解。进行溶解。l IgGIgG稀释液与稀释液与FITCFITC溶液按溶液按:1:1
13、配合，配合，FITCFITC液缓慢液缓慢地加入到地加入到IgGIgG稀释液中，防止出泡。稀释液中，防止出泡。l避光以电磁搅拌器搅拌，其反应时间与温度有关。避光以电磁搅拌器搅拌，其反应时间与温度有关。2 244须须6h6h20202525须须1 12h2h即可。即可。一般以低温标记为最好。一般以低温标记为最好。应用透析法、盐析、凝胶过滤法除去未结合的游离应用透析法、盐析、凝胶过滤法除去未结合的游离荧光素。荧光素。l 4.2.3 4.2.3 应用应用主要用于检测抗原主要用于检测抗原 （定性、定位）（定性、定位）特点：敏感，需荧光特点：敏感，需荧光显微镜显微镜直接法：直接法：病料（病料（AgAg）涂
14、片（切片）涂片（切片）F-AbF-Ab-Ag-Ag镜检镜检间接法：间接法：病料（病料（AgAg）涂片）涂片Ag-Ab1Ag-Ab1 Ag-Ab1-Ab2-F Ag-Ab1-Ab2-F 镜检镜检 F-AbF-AbAb1Ab1Ab2-FAb2-F直接法检测一种抗原就须标记一种特异直接法检测一种抗原就须标记一种特异性的性的AbAbF F ，较特异，较特异 间接法标记一种动物的免疫球蛋白间接法标记一种动物的免疫球蛋白AbAbF F，就能检测多种抗原，较敏感就能检测多种抗原，较敏感 l直接法直接法l1 1、制片：、制片：l待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌材料待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌材料可
15、做成涂片，在室温中自然干燥，病毒抗原通可做成涂片，在室温中自然干燥，病毒抗原通常用冷丙酮固定常用冷丙酮固定l5minl5min，细菌抗原则用加热固，细菌抗原则用加热固定即可。定即可。l2 2、染色：、染色：l滴加荧光抗体，置滴加荧光抗体，置3737染色染色303060min60min，用磷，用磷酸缓冲盐水酸缓冲盐水 (PBS)(PBS)充分洗涤以除去未结合的荧充分洗涤以除去未结合的荧光抗体，加光抗体，加pH9.0pH9.0缓冲甘油缓冲甘油1 1滴，用盖玻片封固。滴，用盖玻片封固。l3 3、镜检：、镜检：l在荧光显微镜下进行检查，抗原所在部位呈黄在荧光显微镜下进行检查，抗原所在部位呈黄绿色荧光。
16、绿色荧光。l4 4、设对照：、设对照：l进行直接荧光染色时，应设以下对照：进行直接荧光染色时，应设以下对照：l（1 1）用荧光抗体染正常组织切片或触片应无）用荧光抗体染正常组织切片或触片应无荧荧光光；l（2 2）将待检材料先用未标记的抗血清处理，）将待检材料先用未标记的抗血清处理，再用荧光抗体染色应不出现荧光。再用荧光抗体染色应不出现荧光。l 间接法间接法l1 1、制片：同直接法、制片：同直接法l2 2、染色：、染色：染色时，标本先滴加抗血清，在染色时，标本先滴加抗血清，在3737处理处理303060min60min；l用用PBSPBS充分洗涤后，再用荧光标记的抗抗体染充分洗涤后，再用荧光标记
17、的抗抗体染色，色，3730373060min60min，洗涤，封固。，洗涤，封固。l3 3、镜检：、镜检：l抗抗体必须与抗血清是相应的，如该抗血清抗抗体必须与抗血清是相应的，如该抗血清是猪源的，则用兔抗猪荧光抗体。是猪源的，则用兔抗猪荧光抗体。l4 4、对照：、对照：l需用正常血清处理作为对照，此对照片应无需用正常血清处理作为对照，此对照片应无荧光。荧光。肝脏肝脏胸腺胸腺肺脏肺脏法氏囊法氏囊肠道肠道脾脏脾脏食道食道荧光抗体技术荧光抗体技术4.2 酶标抗体酶标抗体l酶标抗体酶标抗体是指与底物结合后能显色的是指与底物结合后能显色的酶酶与与抗体抗体连接后所制备的结合物。连接后所制备的结合物。l、原理
18、：、原理：能与被检抗原形成酶标记的免疫复能与被检抗原形成酶标记的免疫复合物，免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，合物，免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，催化无色的底物，生成可溶性或不溶性的有色催化无色的底物，生成可溶性或不溶性的有色产物。根据有色产物的有无及浓度，可对抗原产物。根据有色产物的有无及浓度，可对抗原及抗体做定性、定位和定量测定。及抗体做定性、定位和定量测定。l、酶标抗体的制备酶标抗体的制备l 用于标记的抗体要求高纯高、高效价、与抗原的结合力用于标记的抗体要求高纯高、高效价、与抗原的结合力强，以提取的强，以提取的IgGIgG最为理想。最为理想。l（）免疫球蛋白（）免疫球蛋白IgGI
19、gG的提取：的提取：l（）酶标抗体的标记：（）酶标抗体的标记：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）常用的底物：）常用的底物：邻苯二胺（邻苯二胺（OPDOPD）：）：反应显橙黄色，应避光，致癌性反应显橙黄色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMBTMB）：）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。性，但水溶性差。标记的方法标记的方法 a a.交联法交联法 以双功能交联剂为以双功能交联剂为“桥桥”，分别与酶和抗体，分别与酶和抗体（抗
20、原）连接形成结合物。如（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法戊二醛交联法。b.b.直接法直接法 用用过碘酸钠过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如（如HRPHRP）标记物制备。）标记物制备。NaIONaIO法法标记步骤标记步骤:(1)(1)称取称取5mgHRP5mgHRP溶解于溶解于1ml1ml蒸馏水中。蒸馏水中。(2)(2)于上液中加入于上液中加入0.2ml0.2ml新配的新配的0.1M NaIO0.1M NaIO溶液，室温下溶液，室温下避光搅拌避光搅拌2020分钟。分钟。(3)(3)将上述
21、溶液装入透析袋中，对将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.41mM PH4.4的醋酸钠缓冲的醋酸钠缓冲液透析，液透析，44过夜。过夜。(4)(4)加加20l 0.2M PH9.520l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化的碳酸盐缓冲液，使以上醛化的RPRP的的PHPH升高到升高到9.09.09.59.5，然后立即加入，然后立即加入10mg IgG10mg IgG(抗体抗体)在在1ml 1ml 0.01M0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2 2小时。小时。(5)(5)加加0.1ml0.1ml新配的新配的4mg4mgml NaBHml NaBH
22、液，混匀，再置液，混匀，再置4242小小时。时。(6)(6)将上述液装入透析袋中，对将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS0.15M PH7.4 PBS透析，透析，44过夜。过夜。（7 7）应用盐析、透析法、凝胶过滤法除去未结合的）应用盐析、透析法、凝胶过滤法除去未结合的HRPHRP。l免疫组化法：免疫组化法：应用酶标抗体对生物组织中的抗原进行应用酶标抗体对生物组织中的抗原进行鉴定和定位，称为免疫组化法。鉴定和定位，称为免疫组化法。l酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定 (enzyme linked(enzyme linked immunosorbentimmunosorbent
23、assay)assay)简称简称ELISAELISA：用于可溶性抗原或抗体的定量，是一种用于可溶性抗原或抗体的定量，是一种既特异又敏感的方法。既特异又敏感的方法。酶标抗体的应用酶标抗体的应用 免疫酶技术免疫酶技术 l 其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶试验，底物显色载体，在载体上进行免疫酶试验，底物显色后，用肉眼或分光光度计判定结果，其过程后，用肉眼或分光光度计判定结果，其过程如下。如下。酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(ELISA)(ELISA)l包被抗原（抗体）包被抗原（抗体）洗涤洗涤l底物显色底物显色 洗涤洗涤 抗体（抗原）抗体（
24、抗原）间接间接ELISAELISA：检测抗体检测抗体已知已知AgAg包被加入待检包被加入待检Ab1Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1加入加入Ab2-E Ab2-E Ag-Ab1-Ab2-EAg-Ab1-Ab2-E底物，显色底物，显色Ag-Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1-Ab2-EAg-Ab1-Ab2-E已知已知AgAg底物，显色底物，显色l夹心法：夹心法：先用抗体先用抗体(IgG(IgG)被覆，加待检抗原，被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标记抗体。作用洗涤后，加酶标记抗体。l竞争法：竞争法：用抗体被覆，加一定量的标记用抗体被覆，加一定量的标记抗原和待检抗原混合物，二者竞争与板抗原和待检抗原混合物
25、，二者竞争与板上的抗体结合，显色后与加标记抗原的上的抗体结合，显色后与加标记抗原的对照组比较，试验孔颜色显著低于对照对照组比较，试验孔颜色显著低于对照孔者为阳性孔，待检抗原含量越高，颜孔者为阳性孔，待检抗原含量越高，颜色越浅，此法适于小分子抗原或半抗原色越浅，此法适于小分子抗原或半抗原的检测。的检测。l抗抗体：抗抗体：抗异种动物的抗体，如抗异种动物的抗体，如兔抗猪兔抗猪二二抗、抗、兔抗鸡兔抗鸡二抗。二抗。l用途用途:酶标二抗酶标二抗 荧光标记二抗荧光标记二抗l兔抗猪高免血清的制备兔抗猪高免血清的制备免疫原：免疫原：猪血清猪猪血清猪IgGIgG制备程序：制备程序：采取采取猪血、分离血清猪血、分离
26、血清提取提取IgGIgG取取猪猪IgGIgG接种于接种于家兔家兔（一般次，每（一般次，每次间隔天左右，剂量递增）最后一次间隔天左右，剂量递增）最后一次注射后左右采血检测其琼扩效价，达次注射后左右采血检测其琼扩效价，达：以上时，大量采血，分离血：以上时，大量采血，分离血清。清。4.3 4.3 放射性核素标记技术放射性核素标记技术原理：原理：Ag+AbAg+AbR R Ag-Ab Ag-AbR R 用液相闪烁仪测用液相闪烁仪测R R放出的射线量放出的射线量特点：敏感性极高，但需高级闪烁仪，特点：敏感性极高，但需高级闪烁仪，且同位素对人有放射性危害。且同位素对人有放射性危害。常用的核素有两大类：常用
27、的核素有两大类：射线：射线：131I、125I、57Cr和和60Co射线：射线：14C、3H和和32P。使用最广泛的是：使用最广泛的是：125I 性质活泼、易制备标记物性质活泼、易制备标记物 对被标记物的免疫活性影响小对被标记物的免疫活性影响小 测量方法简便、已推广测量方法简便、已推广 半衰期较长、核素丰度高半衰期较长、核素丰度高 抗原制备抗原制备抗体制备抗体制备抗体和细胞因子抗体和细胞因子 纯化纯化 完全抗原制备完全抗原制备人工抗原制备人工抗原制备血清抗体制备血清抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备硫酸铵盐析硫酸铵盐析离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析免疫亲和层析免疫亲和层析
28、用用 途途类类 型型 用于免疫动物，检测抗体用于免疫动物，检测抗体 用于免疫动物，检测抗体用于免疫动物，检测抗体 用于检测抗原用于检测抗原 用于检测抗原用于检测抗原 初步提纯初步提纯 进一步纯化进一步纯化 进一步纯化进一步纯化 高度纯化高度纯化抗体标记或致敏抗体标记或致敏免疫酶技术免疫酶技术荧光抗体技术荧光抗体技术放射免疫测定放射免疫测定间接凝集试验间接凝集试验技技 术术 酶标记抗体酶标记抗体荧光标记抗体荧光标记抗体同位素标记抗体同位素标记抗体致敏抗体致敏抗体/抗原的制备抗原的制备 免疫血清的制备免疫血清的制备 为含有高效价特异性抗体的血清制剂。为含有高效价特异性抗体的血清制剂。q常用的免疫动
29、物常用的免疫动物q免疫的基本步骤免疫的基本步骤兔子（兔子（rabbitrabbit）、鸡）、鸡(chicken)(chicken)：最常用于自制抗体，：最常用于自制抗体，抗体量较多。抗体量较多。小鼠（小鼠（mousemouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,BALB/C,昆明鼠）昆明鼠）大鼠（大鼠（ratrat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（物。（WistarWistar大鼠）大鼠）羊（羊（sheepsheep、goatgoat）：常用于较大批量地）：常用于较大批量地 生产抗体（商品）。生产抗体（
30、商品）。马（马（horsehorse）：常用于大批量生产治疗用）：常用于大批量生产治疗用 抗体（商品）。抗体（商品）。l2.2.免疫程序免疫程序 一般可分为基础免疫和强化免一般可分为基础免疫和强化免疫两个阶段。疫两个阶段。l 基础免疫：基础免疫：一般先用一般先用弱毒苗弱毒苗/灭活苗灭活苗按按预防剂量预防剂量进行进行首次免疫首次免疫，经，经7 7天天2 2周左右再周左右再用用倍量同种疫苗进行二免倍量同种疫苗进行二免，即完成基础免疫。，即完成基础免疫。有时还需进行有时还需进行3 3次以上的免疫。次以上的免疫。l l强化免疫：强化免疫：基础免疫后基础免疫后2-2-周左右开始周左右开始进行高度免疫，注
31、射进行高度免疫，注射AgAg多为多为强毒强毒，免疫原性，免疫原性良好，免疫剂量逐渐增加，免疫次数视血清良好，免疫剂量逐渐增加，免疫次数视血清抗体效价而定，一般抗体效价而定，一般1-21-2次。但有时需经过次。但有时需经过多次注射。每次注射强毒、多次注射。每次注射强毒、AgAg间隔时间为间隔时间为5-5-7 7天。天。健康动物健康动物首免首免（常规剂量）（常规剂量）二免二免（倍量同种疫苗）（倍量同种疫苗）高度免疫高度免疫（强毒或灭活疫苗）（强毒或灭活疫苗）l注意：注意：l（）一般遵循（）一般遵循剂量（抗原量）渐增，毒剂量（抗原量）渐增，毒力渐强力渐强的原则的原则 (弗氏佐剂除外）弗氏佐剂除外）。
32、l（）注射途径一般采用注射，最好采用分（）注射途径一般采用注射，最好采用分点注射，每一注射点点注射，每一注射点AgAg不宜过多。不宜过多。基础免疫：基础免疫：首次，抗原用量大，用弗氏完全首次，抗原用量大，用弗氏完全佐剂（佐剂（Complate Freund adjuvandComplate Freund adjuvand,含矿含矿物油物油,卡介苗等卡介苗等).).加强免疫：加强免疫：第第2 2次以后，抗原量减半，多次，次以后，抗原量减半，多次，间隔间隔2-42-4周，用弗氏不完全佐剂周，用弗氏不完全佐剂 (Incomplate(Incomplate Freund adjuvandFreund
33、adjuvand,不含卡介苗不含卡介苗).).不溶性盐类胶体佐剂：不溶性盐类胶体佐剂：氢氧化铝胶、明矾等。氢氧化铝胶、明矾等。l 氢氧化铝胶佐剂：氢氧化铝胶佐剂：l最简单的制备方法：最简单的制备方法：AlClAlCl3 3+3NaOH Al(OH)+3NaOH Al(OH)3 3+3NaCl+3NaCl 5 5份份AgAg液液+1+1份铝胶份铝胶 ，室温，室温2 24 4天，弃去部天，弃去部分上清液，混匀分装。分上清液，混匀分装。l 钾明矾：钾明矾：KA1KA1（SOSO4 4）2 2.12 H.12 H2 20 0先配成先配成10%10%溶液，溶液，应用时加入应用时加入1-2%1-2%量与抗
34、原混合。量与抗原混合。l油乳佐剂：油乳佐剂：油水不溶，但在乳化剂存在油水不溶，但在乳化剂存在的情况下，高速搅拌可使二者形成乳剂而的情况下，高速搅拌可使二者形成乳剂而制成的佐剂。制成的佐剂。l油乳佐剂：油乳佐剂：油水不溶，但在乳化剂存在油水不溶，但在乳化剂存在的情况下，高速搅拌可使二者形成乳剂而的情况下，高速搅拌可使二者形成乳剂而制成的佐剂。制成的佐剂。剂型：剂型：油包水型、油包水型、水包油型水包油型水相（水相（AgAg）油相油相 油相油相水相水相 常用的油性佐剂有：常用的油性佐剂有：A A、白油佐剂、白油佐剂 油相：油相：94%94%白油、白油、6%6%司本司本-80-80（去水山梨醇单油酸（
35、去水山梨醇单油酸酯）、酯）、2%2%硬脂酸铝，加热、融化、高压灭菌。硬脂酸铝，加热、融化、高压灭菌。水相：水相：96%Ag96%Ag液，液，4%4%吐温吐温-80-80（聚氧乙烯去水山梨醇（聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯），混匀。单油酸酯），混匀。l 制苗时，将油相于匀浆机内，在低速搅拌下，缓缓制苗时，将油相于匀浆机内，在低速搅拌下，缓缓加入水相（水相加入水相（水相=1=1：2-32-3）后继续高速搅拌）后继续高速搅拌2 2分钟，制成分钟，制成乳白色的油包水型油乳苗，分装。乳白色的油包水型油乳苗，分装。l B B、弗氏佐剂、弗氏佐剂（Freund,s adjuvant，FA）l弗氏不完全佐剂和完全
36、佐剂弗氏不完全佐剂和完全佐剂l 配方：配方：矿物油（石蜡油）矿物油（石蜡油）3 3份份 乳化剂（羊毛脂、吐温乳化剂（羊毛脂、吐温-80-80等）等）1 1份份 磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（PBSPBS）4 4份份 在此混合物中加入卡介苗（在此混合物中加入卡介苗（12mg/ml),12mg/ml),即即为为弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂lB B2 2、弗氏完全佐剂（、弗氏完全佐剂（FreundFreund,s s complete complete adjuvantadjuvant，FCAFCA）在在FIAFIA中加入卡介苗中加入卡介苗12mg/ml12mg/ml；或灭活的分支；或灭活的分支杆菌杆菌10m
37、g/ml10mg/ml。用时佐剂与抗原等量混合。用时佐剂与抗原等量混合。l 卡介苗等分支杆菌细胞壁中的粘肽（卡介苗等分支杆菌细胞壁中的粘肽（胞壁酰胞壁酰二肽，二肽，MDPMDP）具有很强的佐剂活性，它能活化巨）具有很强的佐剂活性，它能活化巨噬细胞，在注射部位形成肉芽肿，吸引吞噬细胞，噬细胞，在注射部位形成肉芽肿，吸引吞噬细胞，进一步增强吞噬细胞和淋巴细胞的活性，使其更进一步增强吞噬细胞和淋巴细胞的活性，使其更易于捕获抗原。易于捕获抗原。在大多数情况下，免疫血清、杂交瘤细胞在大多数情况下，免疫血清、杂交瘤细胞培养上清以及腹水中的抗体需经纯化后再用于培养上清以及腹水中的抗体需经纯化后再用于各种免疫
38、学检测中去。常用的纯化方法有各种免疫学检测中去。常用的纯化方法有盐析盐析法、凝胶过滤、离子交换层析以及亲和层析等法、凝胶过滤、离子交换层析以及亲和层析等方法。方法。这些方法各有优缺点，应根据抗体的特这些方法各有优缺点，应根据抗体的特点、纯度要求和实验室具体条件加以选择。点、纯度要求和实验室具体条件加以选择。l1.1.盐析法盐析法 硫酸铵分段沉淀法硫酸铵分段沉淀法 盐析法原理盐析法原理 蛋白质在不同盐浓度的溶液中其溶解度蛋白质在不同盐浓度的溶液中其溶解度不一样。蛋白质分子量越大沉淀所需盐浓度不一样。蛋白质分子量越大沉淀所需盐浓度越低。在越低。在pH7.0pH7.0时时:50 50硫酸铵硫酸铵:所
39、有的免疫球蛋白都可沉淀；所有的免疫球蛋白都可沉淀；3333硫酸铵硫酸铵:大部分大部分IgGIgG可沉淀出来；可沉淀出来；4040硫酸铵硫酸铵:沉淀物的得率最高，但含沉淀物的得率最高，但含IgMIgM、IgAIgA等等球蛋白部分增多。球蛋白部分增多。因此常用因此常用3333饱和度的硫酸铵提取血清中饱和度的硫酸铵提取血清中的的IgGIgG。l2.2.离子交换层析技术离子交换层析技术 蛋白质的电荷状态可以随着缓冲液蛋白质的电荷状态可以随着缓冲液pHpH的的改变而改变，当改变而改变，当pH7pH7以上时，大多蛋白质带以上时，大多蛋白质带负电荷，而负电荷，而DEAE-DEAE-纤维素带正电荷，当血清纤维
40、素带正电荷，当血清通过通过DEAE-DEAE-纤维素柱时，蛋白质即借静电吸纤维素柱时，蛋白质即借静电吸附在纤维素柱上。附在纤维素柱上。但不同蛋白质的等电点不同、荷电不同、但不同蛋白质的等电点不同、荷电不同、分子大小不同，与交换剂结合强度不同，因分子大小不同，与交换剂结合强度不同，因此可利用不同的洗脱条件将蛋白质分开。此可利用不同的洗脱条件将蛋白质分开。IgG IgG ，IgMIgM，IgAIgA的等电的等电点分别为点分别为pH 8.0pH 8.0、7.07.0、7.47.4。在在pH8.0pH8.0时，时，IgGIgG不带电不带电荷，不能被荷，不能被DEAE-DEAE-纤维素纤维素（带正电）吸
41、附而被洗脱（带正电）吸附而被洗脱下来。故应用下来。故应用pH8.0pH8.0的的Tris-HClTris-HCl作为洗脱液。作为洗脱液。被被DEAE-DEAE-纤维素吸附的纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中盐离子的浓度加洗脱液中盐离子的浓度或降低或降低pHpH的方法将其逐一的方法将其逐一洗脱。洗脱。l原理原理将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于由于流经路径的差异流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离使不同分子质量的组分分离.大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢慢。适合于适合于IgMIgM类抗体的纯化类抗体的纯化 l原理原理l利用蛋白质之间的特异性结合利用蛋白质之间的特异性结合(抗体抗体-抗原，受体抗原，受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合配体）将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相捕捉与它相配的物质。配的物质。l洗脱一般采用改变洗脱一般采用改变pHpH值的方法值的方法使用前样品结合(Binding)洗脱(Elution)l血清血清 硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀 透析透析 过过凝胶过滤柱凝胶过滤柱 过过DEAE-DEAE-纤纤维素柱维素柱 IgGIgG
