1、细菌典型生理生化鉴定技术细菌典型生理生化鉴定技术郑培君郑培君第一节第一节 细菌的生化试验细菌的生化试验一、概述一、概述（一）、什么是生化试验（一）、什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。别细菌的类别、属种的试验。（二）检验细菌的生化试验范围（二）检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验
2、、毒性酶类试验（三）生化试验的方法（三）生化试验的方法1.在培养物中加入某种底物与指示剂在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、经接种、培养后培养后,观察培养基的观察培养基的pH值变化。值变化。2.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。产物所生成的颜色反应。3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。细菌的生长情况。（四）生化试验的注意事项（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养、待检菌应是新鲜
3、培养物。培养1824h。2、待检菌应是纯种培养物。、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为多为24或或48小时。小时。4、应做必要的对照试验、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似待检的疑似菌落分别进行试验。菌落分别进行试验。二、糖醇类代谢试验二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验）试验（三）（三）V-P试验试验（四）甲基红（四）甲基红（Methyl Red）试验）试验 MR（五）七叶苷水解试验（五）七叶苷
4、水解试验（六）甘油品红试验（六）甘油品红试验（一）（一）糖醇类发酵试验糖醇类发酵试验 原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解有的只能分解12种糖醇种糖醇，有的分解糖醇能产，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。些特点，可鉴别细菌。1、常用的糖醇、常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖双糖：乳糖、蔗糖、麦
5、芽糖三糖：棉子糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2、试验方法：、试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置则用接种针作穿刺接种。置361.0 培养培养13天，每天观察结果。天，每天观察结果。3、结果观察和记录、结果观察和记录记录：记录：产酸不产气，阳性，以产酸不产气，阳性，以“+”表示表示 产酸产气，产酸产气，阳性，以阳性，以“”表示表示 不产酸产气，阴性，以不产酸产气，阴性，以“
6、-”表示表示气泡导管气泡气泡阳性阳性阴性培养基变为黄色培养基未变色、无气泡产生（二）葡萄糖氧化发酵（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验）试验1、原理：、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。2、方法、方法 取待检菌
7、，以穿刺法接种于两管葡萄糖取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层半固体培养基上，在其中一管加入一层（约（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在在37培养培养24h天，每天观察结果。天，每天观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录封油管封油管未封油管未封油管发酵型发酵型 产酸（黄色）产酸（黄色）产酸（黄色）产酸（黄色）氧化型氧化型 不产酸（绿色）不产酸（绿色）产酸（黄色）产酸（黄色）产碱型产碱型 不产酸（绿色）不产酸（绿色）不产酸（绿色）不产酸（绿色）（三）（三）V-P试验试验1、原理：、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，某些细菌
8、能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。）反应。2、试验方法、试验方法（1）奥梅拉（）奥梅拉（OMeara）法）法（2）贝立脱（）贝立脱（Barritt）氏法）氏法（3）快速法）快速法（）奥梅拉法：（）奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于水培养基，于361
9、 培养培养48h，每每1mL培养液加奥梅拉培养液加奥梅拉OMeara试剂试剂0.1mL，摇，摇动试管动试管12min，静置于，静置于37恒温箱恒温箱4h，或在或在4850 水浴放置水浴放置2h后判定结果。后判定结果。（2）贝立脱法：）贝立脱法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于养基，于361培养培养2天，每天，每2mL培养液先加培养液先加入入6%a-萘酚纯酒精溶液萘酚纯酒精溶液1mL，再加，再加40%氢氧氢氧化钾水溶液化钾水溶液0.4mL，摇动，摇动25min，阳性菌常立，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或即呈现红色，若无红色出现，静
10、置于室温或361 培养培养 4h，如显现红色为阳性，呈黄，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。色或有类似铜色者，可判定为阴性。（3）快速法：）快速法：将将0.5%肌酸溶液肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入乳化接种于其中，加入5%-萘酚萘酚3滴，滴，40%氢氧化钠水溶液氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置滴，振动后放置5min，判定，判定结果。不产酸的培养物不能使用。结果。不产酸的培养物不能使用。3、结果观察与记录、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，）发酵管
11、出现红色者，为阳性，记记V-P+（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记性，记 V-P-（四）甲基红试验（四）甲基红试验（MR）1、原理、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性
12、产物，培养液成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。2、试验方法、试验方法 挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或或30（以（以30 较好）培养较好）培养35天，从第天，从第48h起，起，每日取培养液每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂，加入甲基红指示剂12滴，滴，立即观察结果。立即观察结果。MR-VP试验原理及照片V-P3、结果观察与记录、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈
13、淡红色为弱阳性，记为弱阳性，记MR+；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，迄，迄至发现阴性并培养至第至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，天仍为阴性，即可判定结果。即可判定结果。MR+MR-（五）（五）七叶苷水解试验七叶苷水解试验、原理：、原理：七叶苷被细菌分解后，生成七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。以此鉴别细菌。2、试验方法、试验方法 将待试纯培养物少许，接种于七叶苷将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于培养基，于361 培养培
14、养24h,观察结果。观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为性，记录为+（2）培养基不变色者，为阴性，记录为）培养基不变色者，为阴性，记录为-（六）（六）甘油品红试验甘油品红试验1、原理：、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法、试验方法 取待检菌的新鲜纯培养物，接种于取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，
15、于甘油品红肉汤培养基中，于361 培培养养8天天,并用未接种的培养基在相同条件并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为阳性，记录为为+；（2）与对照管颜色相同者）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为阴性，记录为为-（六）（六）甘油品红试验甘油品红试验1、原理：、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。物，呈
16、深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法：、试验方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种于取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于甘油品红肉汤培养基中，于361 培培养养8天天,并用未接种的培养基在相同条件并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为阳性，记录为为+；（2）与对照管颜色相同者）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为阴性，记录为为-（一）靛基质（吲哚）试验（一）靛基质（吲哚）试验（二）（二）H2S试验试验（三）尿素酶试验（三）尿素酶试验（四）氨
17、基酸脱羧酶试验（四）氨基酸脱羧酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验（六）明胶（六）明胶（Gelatin）液化试验）液化试验三、氨基酸和蛋白质代谢试验三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一）（一）靛基质试验靛基质试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。2、试验方法：、试验方法：所用试剂所用试剂:（1）柯凡克）柯凡克(Kovacs)试
18、剂试剂;（2）欧）欧波试剂波试剂 将待检菌小量接种于培养基中，于将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养培养2448h时后，加入柯凡克试剂数滴，时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约波试剂约0.5mL覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。阳性反应，无红色者为阴性反应。靛基质试验原理及照片靛基质试验原理及照片 靛基质+3、结果观察与记录、结果观察与记录呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+无红色者，为阴性反应，记-（二）（二）硫化氢（硫化氢（H2
19、S）试验）试验1、原理：、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物铁盐可生成黑色沉淀物PbS或或FeS，以此鉴，以此鉴别细菌。别细菌。2、试验方法：、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于糖铁培养上，于361培养培养2448h，观，观察结果。察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 培养基底部呈黑色，为阳性，记培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记培养基底部无黑色，为阴性，记-（三）（三）尿
20、素酶试验尿素酶试验1、原理：、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。2、试验方法：、试验方法：挑取大量培养挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养作变色对照。培养2、4和和24h分别观察一次结果，分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色
21、不变者为阴性。培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至如阴性应继续培养至4天，作最终判定。天，作最终判定。尿素酶试验图尿素酶试验图 阳性3、结果观察与记录、结果观察与记录 培养基变呈粉红色，为阳性，记培养基变呈粉红色，为阳性，记+培养基颜色不变，为阴性，记培养基颜色不变，为阴性，记 -（四）（四）氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用鸟氨酸生产脱羧作用,生成胺类物质和生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性,如如呈黄色为阴
22、性，以此鉴别细菌。呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。2、试验方法、试验方法 取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在361 培养培养14天，每天观察结果。天，每天观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记记+试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-试试验验管管对照管阳性+阴性-对照管变黄试试验验管管变变黄黄阳性反应试验管颜色变化过程阳性反应试验管颜色变化过程紫色紫色黄色黄色紫色紫色原理：原理：对
23、照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（的早期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液养液pH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，pH又回升又回升至碱性，指示剂显紫色。至碱性，指示剂显紫色。阳性反应试验管颜色变化过阳性反应试验管颜色变化过程：程：紫色紫色黄色黄色紫色紫色（五）（五）苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，使苯丙氨酸脱去氨
24、基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。物，以此鉴别细菌。2、试验方法、试验方法 从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在接种于苯丙氨酸培养基上，在361 培养培养1824h后，加入氯化铁溶液后，加入氯化铁溶液45滴，滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。触，立即观察结果。3、结果观察与记录 试验管立即出现绿色，为阳性，记+无色为阴性，记 -。加氯化铁试剂出现绿色+（六）（六）明胶液化试验明胶液化试验1、原理、原理 有些细菌具有明胶酶
25、（亦称类蛋白水解有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。培养基由固态变为液态。2、试验方法、试验方法 挑取培养挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约刺接种于明胶高层约2/3深度。于深度。于2022培培养养714天。明胶高层亦可培养于天。明胶高层亦可培养于361。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置每天取出两支试管，放入冰箱
26、放置2030min后，再观察结果。后，再观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 明胶液化，为阳性，+。明胶凝固，为阴性，-。四、四、有机酸盐和铵盐的利用试验有机酸盐和铵盐的利用试验 柠檬酸盐利用试验 丙二酸盐利用试验（一）（一）枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验1、原理：、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼碳源，分解枸橼(柠檬柠檬)酸盐生成碳酸盐；酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。淡绿转为深蓝色，为阳性。
27、2、试验方法、试验方法 挑取待检菌，在西蒙柠檬酸盐培养基斜挑取待检菌，在西蒙柠檬酸盐培养基斜面上密集划线接种，在面上密集划线接种，在361 培养培养14天，每天观察结果。天，每天观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记色或深蓝色，为阳性，记+；无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记为阴性，记-柠檬酸盐试验原理及斜面照片 阳性+（二）（二）丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验1.原理原理:某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源作
28、为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠丙二酸盐被分解成碳酸钠,使使培养基变为碱性培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。为阳性，以此鉴别细菌。2、试验方法、试验方法 取待检菌新鲜纯培养物，接种于取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于丙二酸钠培养基上，于361 培养培养48h，观察结果。，观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 培养基由草绿色变成蓝色培养基由草绿色变成蓝色,为阳性为阳性,记记+;培养基无颜色变化培养基无颜色变化,为阴性为阴性,记记-五、五、呼吸酶类试验呼吸酶类试验F氧化酶试验氧化酶试验F过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验F硝酸盐
29、还原试验硝酸盐还原试验F氰化钾试验氰化钾试验（一）（一）氧化酶试验氧化酶试验1.原理原理:氧化酶使细胞色素氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化氧化后，氧化型细胞色素型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物化合物,再和再和-萘酚结合萘酚结合,生成吲哚酚蓝生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。呈蓝色反应，为阳性。试剂 1%-萘酚萘酚-乙醇液乙醇液 1%盐酸二甲基对苯二胺盐酸二甲基对苯二胺2、试验方法、试验方法 用滴管直接滴加用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二盐酸二甲基对苯二胺试剂胺试剂12滴在培养物上滴在培养物上,再加
30、入再加入1%-萘酚萘酚-乙醇液乙醇液12滴滴,在在30秒内判定试验秒内判定试验结果。结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 在在30秒内呈蓝色反应秒内呈蓝色反应,为阳性为阳性,记记 +不变色或为红色者不变色或为红色者,为阴性为阴性,记记 -成蓝色为+不变色或为红色为不变色或为红色为-（二）（二）过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验原理：原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。氧气，产生气泡，即为阳性反应。2、试验方法、试验方法 挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁挑取固体
31、培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。化氢液，立即观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 产生气泡者，为阳性，记产生气泡者，为阳性，记+不产生气泡者，为阴性，记不产生气泡者，为阴性，记-（三）硝酸盐还原试验（三）硝酸盐还原试验1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯亚硝酸盐可
32、生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与与-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。反应，为阳性反应。试剂 A、对氨基苯磺酸试剂、对氨基苯磺酸试剂 B、-萘胺试剂萘胺试剂2、试验方法、试验方法 取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在基上接种，在361 培养培养14天，每天，每天取天取2mL培养液培养液,加入加入A、B试剂的等量试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。混合物各二滴混匀，立即观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 呈现红色
33、，为阳性，记呈现红色，为阳性，记+若无红色出现，为阴性，记若无红色出现，为阴性，记-（四）（四）氰化钾试验氰化钾试验1.原理：原理：氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与可与呼吸酶作用使酶失去活性呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长能生长,以此鉴别细菌以此鉴别细菌.2、试验方法、试验方法 取培养取培养2024h的营养肉汤培养液或的营养肉汤培养液或菌落菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，养基内，立即以橡胶塞塞紧，361
34、 培养培养24 48h，观察结果。，观察结果。3、结果观察与记录、结果观察与记录 对照管有菌生长，试验管有菌生长对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记为阳性，记+。对照管有菌生长，试验管无菌生长对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记为阴性。记-。六、毒性酶类试验六、毒性酶类试验F溶血试验溶血试验F链激酶试验链激酶试验F卵磷脂酶试验卵磷脂酶试验F血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验（一）（一）溶血试验溶血试验1、原理：、原理：某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌
35、。细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。2、试验方法、试验方法 平板法平板法 试管法试管法平板法平板法 将培养物接种于血平板培养基上，将培养物接种于血平板培养基上，361 培养培养24 48h，观察结果。，观察结果。溶血试验的溶血类型及现象溶血试验的溶血类型及现象（1）（甲型）溶血（甲型）溶血:菌落周围出现较窄的菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。半透明的草绿色溶血环。（2）（乙型）溶血（乙型）溶血:菌落周围出现较宽的菌落周围出现较宽的透明溶血环。透明溶血环。（3）（-丙型）溶血丙型）溶血:菌落周围无溶血环。菌落周围无溶血环。甲型（-）溶血乙型（-）溶血丙型（-）溶血试管法 将待检菌培养液
36、与等量的将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，羊血球混合，在在361 培养培养16 18h，观察结果。如溶，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。血，培养液可出现透明状。3、结果观察与记录、结果观察与记录 有溶血现象，为阳性，记有溶血现象，为阳性，记+；无溶血现象，为阴性，记无溶血现象，为阴性，记-（二）（二）链激酶试验链激酶试验1、原理：、原理：A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解解纤维蛋白，使血凝块溶解,为阳性反应。为阳性反应。此试验用于测定链球菌的致病
37、性。阳性反此试验用于测定链球菌的致病性。阳性反应具有致病性。应具有致病性。2、试验方法、试验方法 吸取草酸钾血浆吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入加入0.8 mL生理盐水，混匀后，再加入待检菌生理盐水，混匀后，再加入待检菌36下培养下培养18-24h肉汤培养物肉汤培养物0.5 mL和和0.25氯氯化钙化钙0.25 mL，混匀，放，混匀，放37水浴中，水浴中，2 min观观察一次。察一次。待血浆凝固后继续观察并记录溶化时待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如间。如2 h内不溶化，继续放置内不
38、溶化，继续放置24 h后观察。后观察。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。链激酶阳性的菌株做阳性对照。3、结果观察与记录、结果观察与记录 如凝块全部溶化如凝块全部溶化,为阳性为阳性+，凝块凝块24 h仍不溶化仍不溶化,为阴性为阴性-（三）卵磷脂酶试验（三）卵磷脂酶试验1、原理：、原理：某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或
39、混浊白环，或落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。2、试验方法、试验方法（1）卵黄平板法：）卵黄平板法：A法：法：将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，平板上，361 培养培养3 6h，观察结果。，观察结果。菌落白色混浊环，B 法：法：先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于36 待干后，将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄待干后，将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半，琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半，36
40、1 厌氧培养厌氧培养24 48h，观察结果。，观察结果。在未涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较在未涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较大的不透明乳白色混浊区，在涂抗血清的一半平板大的不透明乳白色混浊区，在涂抗血清的一半平板上，菌落周围无不透明混浊区，为阳性。上，菌落周围无不透明混浊区，为阳性。两边均无不透明区，为阴性。两边均无不透明区，为阴性。菌落周围无混浊白环菌落周围有混浊白环乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，（2）卵黄盐水法）卵黄盐水法 将庖肉培养基培养物经除菌过滤，收集滤将庖肉培养基培养物经除菌过滤，收集滤液。在两支灭菌试管内
41、，每管加入液。在两支灭菌试管内，每管加入1%卵黄盐卵黄盐水水0.4mL,在一管中加入滤液在一管中加入滤液0.2mL，另一管加，另一管加入生理盐水入生理盐水0.2mL作对照。在作对照。在36 水浴中，水浴中，经经2h、4h、8h、24h观察结果。观察结果。管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。阳性。3、结果观察与记录、结果观察与记录菌落周围形成较大的不透明区，为阳性。菌落周围形成较大的不透明区，为阳性。两边均无不透明区，为阴性。两边均无不透明区，为阴性。管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性两管无沉淀者，为阴性。两
42、管无沉淀者，为阴性。（四）（四）血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。为阳性。2、试验方法、试验方法（1）玻片法：）玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别
43、与生理盐一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，水和血浆混合，5 min内内,如血浆内出现团块或颗粒状如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性;如两者呈均如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。匀混浊，无凝固则为阴性。有凝块均匀混浊血浆生理盐水血浆凝固酶试验阳性反应阴性反应不凝固少量、零散凝固明显的块状凝固巨大块凝固完全凝固，倒置不流动金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验 3、试管法的结果观察与记录、试管法的结果观察与记录 空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，
44、试验管血浆凝固者为阳性；血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；均无凝固则为阴性。均无凝固则为阴性。三糖铁（三糖铁（TSI）试验）试验1、三糖铁试验的原理、三糖铁试验的原理 如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红
45、色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。保持黄色。如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。培养基底部变黑。制好的培养基对照管斜面红色，底面黄色培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，产生H2S底面黄色，并产生CO22、试验方法、试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养培养1824h，观察结果。，观察结果。下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺
46、氏菌？2志贺氏菌志贺氏菌3沙门氏菌沙门氏菌4大肠杆菌大肠杆菌第二节第二节 血清学试验血清学试验血清学反应：血清学反应：指相应的抗原与抗体在体指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。沉淀、凝集现象。一、抗原与抗体一、抗原与抗体（一）抗原（一）抗原1、抗原的概念、抗原的概念 抗原抗原(Ag)：是指凡能刺激机体免疫系统：是指凡能刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与应答产生的抗体或诱导免疫应答，并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。2、抗原的特性、抗原的特性免疫原性免疫原性反应原性反应原性
47、（二）抗体（二）抗体1、抗体：是指机体内的淋巴系统细胞在抗原、抗体：是指机体内的淋巴系统细胞在抗原物质的激发下，所合成的一种具有特异性免物质的激发下，所合成的一种具有特异性免疫功能的球蛋白疫功能的球蛋白(免疫球蛋白免疫球蛋白)。2、抗体的理化性质、抗体的理化性质（1）抗体是球蛋白）抗体是球蛋白（2）免疫球蛋白）免疫球蛋白兔血清电泳分离图经对不同免疫血清的电泳分析，超速离心分析和分子量测定等经对不同免疫血清的电泳分析，超速离心分析和分子量测定等方法，发现大部分抗体活性存在于方法，发现大部分抗体活性存在于球蛋白内，但有小部分抗体球蛋白内，但有小部分抗体活性可存在于活性可存在于球蛋白内。它们的离心常
48、数分别为球蛋白内。它们的离心常数分别为7S和平共处和平共处19S，分子量分别为，分子量分别为16万和万和90万。因此它们分别被命名为万。因此它们分别被命名为7S球球蛋白分子（蛋白分子（16万）万）19S2巨球蛋白分子巨球蛋白分子(2M,90万万)和和2A球蛋白球蛋白分子，所以从早期对抗体性质的研究证明抗体不是由均质性球分子，所以从早期对抗体性质的研究证明抗体不是由均质性球蛋白组成，而是由异性球蛋白组成。蛋白组成，而是由异性球蛋白组成。（三）抗原抗体反应（三）抗原抗体反应抗原抗体反应：是指抗原与相应抗抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应体之间所发生的特异性结合反应 第一节第
49、一节 抗原抗体反应的原理抗原抗体反应的原理 抗原抗体反应抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。的特异性结合反应。物质基础物质基础:抗原表位与抗体高变区间的互补结合抗原表位与抗体高变区间的互补结合 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合 抗原抗体之间的结合力抗原抗体之间的结合力 亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体静电引力静电引力（electrostatic forces）范德华引力范德华引力:作用最小作用最小（van der Waals interactions）氢键氢键:最具特异性最具特异性（hy
50、drogen bond）疏水作用力疏水作用力:作用最大作用最大（hydrophobic interactions）抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力示意图一、抗原抗体结合力一、抗原抗体结合力抗体结合部位抗体结合部位与抗原表位之与抗原表位之间结合的强度间结合的强度亲合力亲合力(avidity)抗原抗体亲合力示意图抗原抗体亲合力示意图抗体分子上一个抗抗体分子上一个抗原结合点与对应的原结合点与对应的抗原决定簇之间相抗原决定簇之间相适应而存在着的引适应而存在着的引力，是抗原抗体间力，是抗原抗体间固有的结合力固有的结合力亲和力亲和力(affinity)抗原抗体亲和力示意图抗原抗体亲和力示意图二、抗原抗体
