1、细胞培养技术实用篇细胞培养的优点细胞培养的优点活细胞长时间、直接观察、研究活细胞的形态、活细胞长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构和生命活动结构和生命活动可控制可控制选择特定的细胞种类、性质、阶段选择特定的细胞种类、性质、阶段可控制调节条件物理、化学、生物等可控制调节条件物理、化学、生物等可采用各种研究技术、记录方法可采用各种研究技术、记录方法样品均一性来源于同一组织同一种细胞样品均一性来源于同一组织同一种细胞经济、规模经济、规模局限性局限性人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和缺乏体内的系统作用、失去神经体
2、液的调节和细胞相互间的影响细胞相互间的影响体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环境中，必然发生变化。境中，必然发生变化。本章主要内容本章主要内容细胞培养的基本操作技术细胞培养的基本操作技术原代培养原代培养(primary culture)(primary culture)传代培养传代培养(subculture)(subculture)体外培养细胞的影响因素体外培养细胞的影响因素细胞培养污染及对策细胞培养污染及对策培养细胞的生长测定方法培养细胞的生长测定方法细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏细胞培养中的常用术语细胞培养中的常用术语组织培养组织培养(Tissue
3、 Culture)(Tissue Culture)指的是从体内取出指的是从体内取出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并维组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。持其结构和功能的方法。器官培养（器官培养（Organ CultureOrgan Culture）培养的是器官的原培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。生长和保持一定功能的方法。细胞培养细胞培养(Cell Culture)(Cell Culture)培养物是单个细胞和培养物是单个细胞和细胞群。细胞群。细胞培养中的常用术语
4、细胞培养中的常用术语原代培养（原代培养（primary cultureprimary culture）从体内取出细胞）从体内取出细胞或组织的第一次培养。或组织的第一次培养。传代（传代（passagepassage）也称再培养。无论是否稀释，）也称再培养。无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。即称为传代或传代培养。也称再培养。细胞系（细胞系（cell linecell line）原代培养物经首次传代成）原代培养物经首次传代成功后即为细胞系功后即为细胞系细胞培养中的常用术语细胞培养中的常用术语细胞株（细胞
5、株（cell straincell strain）通过选择法或克隆形成法从）通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。的培养物称细胞株。汇合（汇合（confluentconfluent）细胞相互连接成片占据所有底物）细胞相互连接成片占据所有底物面积。面积。接触抑制（接触抑制（contact inhibitioncontact inhibition）细胞汇合相互接）细胞汇合相互接触后失去运动的现象触后失去运动的现象一、细胞培养基本操作技术一、细胞培养基本操作技术 由于体外培养的由于体外培养的细胞没有抗感染能力
6、，细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培因此防污染是决定培养成功的首要条件。养成功的首要条件。一切操作需要保证一切操作需要保证无菌和有条不紊。无菌和有条不紊。培养前准备培养前准备制定好实验计划和操作程序制定好实验计划和操作程序有关数据的计算要事先做好。有关数据的计算要事先做好。准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置在操作场所在操作场所(培养室、超净台培养室、超净台)内，然后开始消毒。内，然后开始消毒。避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。染机会。消毒消毒地面每天都要用地面每天都要用0.2%0.2
7、%的新洁尔灭拖洗地面的新洁尔灭拖洗地面次次(拖布拖布要专用要专用)，紫外线照射消毒，紫外线照射消毒3050min3050min超净工作台台面每次实验前要用超净工作台台面每次实验前要用7575酒精擦洗。然酒精擦洗。然后紫外线消毒后紫外线消毒30min30min。消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用等用75%75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。洗手和着
8、装洗手和着装原则上和外科手术相同。原则上和外科手术相同。仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射线照射30min30min的清洁工作服的清洁工作服在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用7575酒精消酒精消毒手。毒手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。专用鞋或带鞋套专用鞋或带鞋套火焰消毒火焰消毒在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先在无菌环境进行培养
9、或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。要点燃酒精灯。按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。处并经过烧灼进行。如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞。以防烧死细胞。操作操作进行培养时，动作要准确敏捷进行培养时，动作要准确敏捷不能不能太快，太快，否则否则空气流动增加污染机会。空气流动增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。用火焰烧灼消毒或取备品更换。组织细胞取材及培养的基本要求组织细胞取材及培养的基本要求
10、l取材的组织用培养液浸泡，取材的组织用培养液浸泡，44运送，运送，24h24h内尽快培养。内尽快培养。l取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。霉素和制霉菌素漂洗。l原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的培养液。培养液。l一般来讲一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低分化低的较分化高的组织容易生长的较分化高的组织容易生长;肿
11、瘤组织较正常组织容易肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。l为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。本，对供体来源、部位及一般情况做记录。组织材料的分离组织材料的分离机械法适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、机械法适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、胸腺等。剪切组织为胸腺等。剪切组织为1mm31mm3碎块后，置于组织匀浆碎块后，置于组织
12、匀浆器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。化学法胰蛋白酶、胶原酶、化学法胰蛋白酶、胶原酶、EDTAEDTA法法细胞悬液的分离方法低速离心法、密度梯度离心细胞悬液的分离方法低速离心法、密度梯度离心法法组织样本原代培养的污染多数来源于组织样本；不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。然后紫外线消毒30min。如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。细胞培养(Cell
13、 Culture)培养物是单个细胞和细胞群。适于分离密度不等的细胞。有的散在生长，倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列，培养液一般不发生浑浊。细胞悬液的分离方法低速离心法、密度梯度离心法减少空气流动是防止污染的重要环节。3HTdR掺入法和BrdU掺入法吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。神经元胞体呈圆形或长杆状,核大而圆,核仁明显.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的常用介质有Ficoll 400
14、，Percoll，泛影葡胺等。细胞质回缩，胞质呈圆球形对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。细胞悬液的分离方法细胞悬液的分离方法低速离心法低速离心法 血液和体液等细胞悬液血液和体液等细胞悬液5001000rpm5001000rpm离心离心510min510min。离心速度过大、时间。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。过长，会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心法密度梯度离心法 用离心法将细胞分到不同密用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的细胞。常用介质有分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400Fico
15、ll 400，PercollPercoll，泛影葡胺等。，泛影葡胺等。胰蛋白酶（胰蛋白酶（TrypsinTrypsin）对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。消化效果与消化效果与PHPH值、温度、酶浓度和组织块大小与值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关。硬度有关。适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效但若与胶原子宫、纤
16、维肉瘤、肿瘤组织等无效但若与胶原酶合用能增加其对组织的分离作用酶合用能增加其对组织的分离作用 。钙镁离子和血清抑制其活性。钙镁离子和血清抑制其活性。常用剂量为常用剂量为0.25%0.25%，PH8PH8，温度，温度3737胶原酶法（胶原酶法（collagenasecollagenase）水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影响不大。响不大。产品有产品有 等型，分别适用于分离肝细胞、等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞及纤维组织。胰岛、脂肪细胞及纤维组织。钙镁离子和血清不影响活性，钙镁离子和血清不影响活性，PH6.57PH6.57常用剂量为常用剂量
17、为200U/ml200U/mlEDTAEDTA法法EDTAEDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白酶混合使用酶混合使用(11(11或或21)21)，既利于细胞脱壁又利于，既利于细胞脱壁又利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。E
18、DTAEDTA工作液的浓度为工作液的浓度为0.020.02，用不含钙、镁，用不含钙、镁PBSPBS配制。配制。二、原代培养二、原代培养(primary culture)(primary culture)从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养，即将动物机体的各种组织从机体中取出，养，即将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTAEDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生
19、长和繁殖的过程。和繁殖的过程。原代培养细胞原代培养细胞组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的很好对象；很好对象；原代细胞培养也是建立各种细胞系（原代细胞培养也是建立各种细胞系（cell line)cell line)或或细胞株（细胞株（cell straincell strain）必须经过的阶段。）必须经过的阶段。原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复杂
20、，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质性（性（heterogeneous),heterogeneous),主要表现在细胞形态和大小主要表现在细胞形态和大小不一不一原代培养的方法原代培养的方法悬浮细胞培养法悬浮细胞培养法器官培养法器官培养法组织块培养法组织块培养法细胞培养法细胞培养法悬浮细胞培养法悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞如白血病细胞、淋巴细对于悬浮生长的细胞如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无须消化，可采用低速离心分离细胞无须消化，可采用低速离心分离,直接培直接培养。养。器官培养
21、器官培养(organ culture)(organ culture)指组织、器官原基，以至整个器官或其指组织、器官原基，以至整个器官或其一部分在体外的维持或生长，它们可以一部分在体外的维持或生长，它们可以分化与保持原来的结构与功能。分化与保持原来的结构与功能。细胞培养法细胞培养法方法与步骤方法与步骤1)1)动物处死将出生动物处死将出生2 23d3d乳鼠，乳鼠，用脱颈方法处死。用酒精棉球用脱颈方法处死。用酒精棉球 擦拭解剖部位。擦拭解剖部位。2)2)取材及剪切在无菌条件下将取材及剪切在无菌条件下将 组织取出，置于无菌培养皿中，组织取出，置于无菌培养皿中，剪去多余的组织（脂肪等），剪去多余的组织（
22、脂肪等），用用PBSPBS液洗涤液洗涤1212次；放入另一次；放入另一 培养皿中，将组织剪成培养皿中，将组织剪成1mm31mm3大大 小的块。小的块。细胞培养法细胞培养法方法与步骤方法与步骤3)3)消化及分散组织块将上述清洗过的组织放入消化及分散组织块将上述清洗过的组织放入无菌试管内，加入无菌试管内，加入5 56 6倍量的倍量的0.250.25胰蛋白酶胰蛋白酶液（液（pH7.4 pH7.4 7.6 7.6），置），置3737水浴中消化水浴中消化20 20 40min40min，每隔，每隔10min10min摇动一次，直到组织块变得摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试
23、疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管，加入管，加入5ml5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。纱布过滤至另一烧杯中。细胞培养法细胞培养法方法与步骤方法与步骤4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含3 5105个细胞为宜。5)分装与培养将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶 or 培养皿中，盖好，做好标记，置于37 CO2培养箱中培养。6)观察逐日检查培养物是否污染，观察细胞
24、生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。噻唑蓝（MTT）比色法组织取出，置于无菌培养皿中，氢化可的松可促进表皮细胞和乳腺上皮细胞生长，并能提高胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率，用量为108 107mol/L。有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常有关数据的计算要事先做好。汇合（confluent）细胞相互连接成片占据所有底物面积。快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。另外随着细胞种类增多不同种细
25、胞交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。与抗生素联合应用效果更佳。3HTdR掺入法和BrdU掺入法培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质性（heterogeneous),主要表现在细胞形态和大小不一传代培养(subculture)然后紫外线消毒30min。由于体外培养的密度梯度离心法 用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。不同的细胞对培养基需求不同，当
26、前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；细胞培养法细胞培养法注意事项注意事项取材的组织最好尽快培养取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡于，若不能及时培养，可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或培养液内放置于冰浴或4 40 0C C冰箱。若组织块很大，应先将其切成冰箱。若组织块很大，应先将其切成1cm21cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过以下的小块再低温保存，但时间不能超过2424小时，因放置时间小时，因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡；长或组织块太大都易造成细胞的死亡；取材时
27、严格无菌操作取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。学试剂及有害药物如碘、汞等。3.3.取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中；少量培养液中；组织块培养法组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的组织块培养是常用、
28、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故也被称为组织培养故也被称为组织培养(tissue culture)(tissue culture)。组织块培养法组织块培养法(1)(1)取材、修剪、组织剪或切成取材、修剪、组织剪或切成1mm1mm3 3左右的小左右的小 块。块。(2)(2)将将 剪切好的组织小块用眼科镊送入培剪切好的组织小块用眼科镊送入培 养养 瓶瓶内。内。25ml25ml培养瓶培养瓶(底面积约为底面积约为17.5cm17.5cm2 2）以）以2020一一3030小块为宜。小块为宜。(3)(3)放置放置24h24h待组织
29、小块贴附后将培养瓶慢慢待组织小块贴附后将培养瓶慢慢翻转平放、静止培养翻转平放、静止培养注意事项注意事项组织块接种后组织块接种后l3 l3天，游出细胞数很少天，游出细胞数很少,组织块的组织块的粘贴不牢固。观察、移动过程中要注意动作轻粘贴不牢固。观察、移动过程中要注意动作轻巧。尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块巧。尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。的冲击力使其漂起。在原代培养的在原代培养的12d12d内要持别注意观察，是否有内要持别注意观察，是否有细菌、霉菌的污染。一旦发现，要及时清除，细菌、霉菌的污染。一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其它细胞带来污染。以防给培养箱内的
30、其它细胞带来污染。原代培养原代培养35d35d需换液一次，去除漂浮的组织块需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞，以免影响原代细胞的生长。和残留的血细胞，以免影响原代细胞的生长。几种细胞的原代培养图示几种细胞的原代培养图示1.细胞种类：人肺细胞种类：人肺 部部 成成 纤纤 维维 细细 胞胞 ；2.培养的天数：培养的天数：2d-4d-7d;3.放大倍数：放大倍数：200倍倍 ；4.培养基种类：培养基种类：1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，细胞呈梭形，贴壁生长贴壁生长;几种细胞的原代培养图示几种细胞的原代培养图示 1.1.细胞种类小鼠胚细
31、胞种类小鼠胚胎成纤维细胞胎成纤维细胞 2.2.培养的天数培养的天数4d4d；3.3.放大倍数倒置显微放大倍数倒置显微镜镜 ；4.4.培养基种类培养基种类1640+10%X1640+10%X小牛血清；小牛血清；5.5.细胞状态与特征简细胞状态与特征简述述:细胞呈长梭形，贴壁细胞呈长梭形，贴壁生长生长 几种细胞的原代培养图示几种细胞的原代培养图示神经元原代培养神经元原代培养:神经元是高度神经元是高度分化的细胞分化的细胞,在体外培养条件下难在体外培养条件下难以增殖以增殖.因此因此,目前神经元的培养目前神经元的培养主要用于原代培养主要用于原代培养.神经元胞体呈圆形或长杆状神经元胞体呈圆形或长杆状,核大
32、核大而圆而圆,核仁明显核仁明显.可见有细小突起可见有细小突起从胞体长出从胞体长出.培养液中需加入高浓度的葡萄糖培养液中需加入高浓度的葡萄糖,以利于神经元的生长以利于神经元的生长.三、传代培养三、传代培养(passage or subculture)(passage or subculture)细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。不论是否稀释，就必须进行传代（再培养）。不论是否稀释，将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养将细胞以一个培养瓶
33、转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养瓶即称为传代或传代培养(passage)(passage)。细胞的传代培养细胞的传代培养根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有2 2种。种。悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代离心法传代离心（离心法传代离心（1000rpm1000rpm）去上清，沉）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将直接传代法悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除上清培养液去除l l2 22 23 3，然后用吸管，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。直接吹打形成细胞悬液再传代。细胞的传代培养细胞的传
34、代培养贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。在传代时，需要采用酶消化法传代。在传代时，需要用胰蛋白酶将细胞消化，使其从支持物用胰蛋白酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用上脱落，或用EDTAEDTA溶液与胰蛋白酶按溶液与胰蛋白酶按1111或或2121比例混合后联合使用。常用的消化比例混合后联合使用。常用的消化液有液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。Optimal confluency for moving cells to a new dish is 7080%too low,cells will be in lag phase and wont proliferat
35、eToo high and cells may undergo unfavorable changes and will be difficult to remove from plate吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡细胞株（cell strain）通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。二、原代培养(primary culture)25胰蛋白酶液（pH7.支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的在培养液中加入适量的抗菌素。原代细胞第1次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。因此，除满足营养
36、的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。剪去多余的组织（脂肪等），常用的排除微生物污染的方法有以下4种一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。细胞株（系）条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。细胞附着于底物上，游离期结束。有关数据的计算要事先做好。几种细胞的原代培养图示贴壁生长细胞传代方
37、法贴壁生长细胞传代方法酶消化过程酶消化过程酶消化过程酶消化过程注意问题注意问题操作全过程注意无菌操作操作全过程注意无菌操作胰酶消化时间要适度胰酶消化时间要适度吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡贴壁生长细胞的生长过程贴壁生长细胞的生长过程游离期游离期贴壁期贴壁期潜伏期潜伏期对数生长期对数生长期停止期（平台期）停止期（平台期）游离期游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期期细胞质回缩，胞质呈圆球形细胞质回缩，胞质呈圆球形1010分钟分钟4 4小时小时贴壁期贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。细胞附着于底物上，游离期结
38、束。底物胶原、玻璃、塑料等底物胶原、玻璃、塑料等细胞株平均在细胞株平均在1010分钟分钟4 4小时贴壁小时贴壁血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白。胶原等糖蛋白。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）基团）潜伏期、对数生长期、停止期潜伏期、对数生长期、停止期潜伏期细胞有生长活动，而无细胞分裂，细胞潜伏期细胞有生长活动，而无细胞分裂，细胞株潜伏期一般为株潜伏期一般为624624小时。小时。对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实
39、验研究。最佳，最适合进行实验研究。停止期细胞长满瓶壁，虽有活力但不再分裂，停止期细胞长满瓶壁，虽有活力但不再分裂，机制为接触抑制、密度依赖性。机制为接触抑制、密度依赖性。四、影响体外培养细胞的因素四、影响体外培养细胞的因素组织和细胞供体年龄组织和细胞供体年龄培养条件培养条件细胞的粘附细胞的粘附培养技术方法培养技术方法促生长因子促生长因子组织和细胞供体年龄组织和细胞供体年龄幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎组织都是最好的培养对象。组织都是最好的培养对象。来自同一个体的组织，分化低的比分化高的容来自同一个体的组织，分化低的比分化高的容易培养。易培养。培
40、养条件培养条件不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所培养细胞的生物学性状和特殊需求成分。培养细胞的生物学性状和特殊需求成分。细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、气体环境、温度、渗透压、气体环境、PHPH值等均能影响细胞值等均能影响细胞的
41、生长的生长。细胞贴附的过程细胞贴附的过程影响细胞贴附的因素影响细胞贴附的因素细胞类型细胞类型 (附着最强附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞巨噬细胞一成纤维细胞上皮上皮细胞细胞血细胞血细胞(最弱最弱)生物因素生物因素 血清、培养液中的促附着因子血清、培养液中的促附着因子 机械，物理等其他因素机械，物理等其他因素离心促进附着离心促进附着流动培养液流动可阻止细胞附着流动培养液流动可阻止细胞附着低温可抑制附着低温可抑制附着促生长因子促生长因子现已证明，很多激素如胰岛素、氢化可的松等具有促进细胞生长作用。胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，用量为110U/ml。氢化可的松可促进表皮细胞和乳腺上皮细胞生长，并
42、能提高胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率，用量为108 107mol/L。人表皮生长因子（hEGF)对大鼠宫颈鳞状上皮细胞(RCEC)有促进增殖的作用。表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等生长调节因子都能促进细胞的生长和增殖。五、细胞培养污染及对策五、细胞培养污染及对策培养细胞生长状况常规检查培养细胞生长状况常规检查培养液颜色与透明度的变化培养液颜色与透明度的变化细胞生长状况。细胞生长状况。细胞形态变化。细胞形态变化。微生物污染微生物污染培养液培养液PHPH值值（颜色变化）（颜色变化）变黄，表示变黄，表示PHPH值下降，细胞生长旺盛，代谢值下降，细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物不
43、断积累导致。产生的酸性物不断积累导致。变红或紫红色，表示变红或紫红色，表示PHPH值上升，细胞生长停值上升，细胞生长停滞、死亡。滞、死亡。一般生长稳定的细胞需要一般生长稳定的细胞需要2323天换液天换液1 1次，生长次，生长慢的细胞需要慢的细胞需要3434天换液一次。天换液一次。细胞换液细胞换液原代细胞经原代细胞经2424小时培养，培养液颜色变浅，表示小时培养，培养液颜色变浅，表示细胞代谢好。少量换液可刺激细胞生长。细胞代谢好。少量换液可刺激细胞生长。通常每周两次，每次换半量或通常每周两次，每次换半量或1/51/31/51/3量。原代细量。原代细胞第胞第1 1次换液时，切记不要把培养液全部倒掉
44、。次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。细胞株（系）条件合适时生长迅速，过夜就变黄，细胞株（系）条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。种数，延长换液的时间。细胞生长状况细胞生长状况常规应特别注意细胞的生长增殖情况。常规应特别注意细胞的生长增殖情况。原代细胞经历一个适应或潜伏期。原代细胞经历一个适应或潜伏期。细胞系多为细胞系多为2424小时以内。小时以内。细胞长满瓶底细胞长满瓶底80%80%时应及时传代。时应及时传代。细胞形态变化细胞形态变化生长良好细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。生长良好细胞透明
45、度大，折光性强，轮廓不清。生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。之间空隙加大。微生物污染微生物污染培养液颜色与透明度培养液颜色与透明度培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明显变缓。显变缓。细胞培养污染的概念细胞培养污染的概念不仅仅指微生物，包括所有混入培养环境中对细不仅仅指微生物，包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此
46、胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此一般包括微生物一般包括微生物(真菌、细菌、病毒和支原体真菌、细菌、病毒和支原体)、化学物质化学物质(影响细胞生存、非细胞所需的化学成份影响细胞生存、非细胞所需的化学成份)及细胞及细胞(非同一种的其它细胞非同一种的其它细胞)。其中以微生物污。其中以微生物污染最多见。另外随着细胞种类增多不同种细胞染最多见。另外随着细胞种类增多不同种细胞交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。污染的途径污染的途径空气空气是微生物传播的最主要途径。空气空气是微生物传播的最主要途径。净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可净化工作台使用过久，滤
47、器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行使净化工作不能正常进行工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强等使外界气流过强减少空气流动是防止污染的重要环节。减少空气流动是防止污染的重要环节。污染的途径污染的途径器材各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底器材各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底 洗刷不干净，污物残留及培养用液等灭菌不洗刷不干净，污物残留及培养用液等灭菌不彻底彻底CO2CO2温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取温箱由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而孽生，而CO2
48、CO2温箱内是开放式培养如不定期温箱内是开放式培养如不定期消毒消毒,可形成污染可形成污染.污染的途径污染的途径操作操作无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或封瓶时不严封瓶时不严培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。污染的途径污染的途径血清有些血清在生产时就已被支原体或病毒等血清有些血清在生产时就已被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。污染，即可成为污染的来源。组织样本原代培养的污染多数来源于组织样本；组织样本原代培养的污染多
49、数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。中的碘可以影响细胞生长。污染对细胞的影响污染对细胞的影响支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的的、缓慢的和潜在的霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。生长或产生有毒物质杀灭细胞。化学物质污染如重金属或其它化学试剂混入培养化学物质污染如重金属或其它化学试剂混入培养液中后，有的毒性较小、如能及时排出，细胞仍液中后，有的毒性较小、如能及时排出，
50、细胞仍可存活但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，可存活但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，能导致细胞发生转化能导致细胞发生转化细菌的污染和检测细菌的污染和检测细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌、白色葡萄球菌，枯草杆菌、白色葡萄球菌，以及大肠杆菌、假单以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。胞菌等革兰氏阴性菌。培养细胞受细菌污染后，培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，会
