1、1鼠疫实验室检测技术鼠疫实验室检测技术2鼠疫实验室检测鼠疫实验室检测针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营养需求、毒素检测、毒力测定等。针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫菌全基因组测定；插入序列的检测。3一、鼠疫菌菌体形态检查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长12m，宽，宽0.50.7m,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无
2、芽胞。的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。革兰氏染色阴性。染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌，菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌，对于鉴别杂菌污染材料极有价值。对于鉴别杂菌污染材料极有价值。鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）显）、姬姆萨染色（菌
3、体染成色，荚膜染成色）4鼠疫菌染色检查(脏器压印片)美兰染色革兰氏染色5鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革兰氏染色6鼠疫菌染色检查Wayson stain(魏申氏染色)呈现的两极浓染特征荚膜染色墨汁负染色7二、鼠疫菌的培养特性u鼠疫菌是典型的异养菌。鼠疫菌是典型的异养菌。u鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。u鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28，最适，最适pH为为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为）约为100150mV，接种后至少，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的
4、菌落，以上才能形成肉眼可见的菌落，一般一般2448h形成肉眼可见的小菌落。形成肉眼可见的小菌落。u强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37缺钙缺钙条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达和表现很强的表达和分泌毒力蛋白分泌毒力蛋白V抗原（抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受）。此现象称为低钙反应，受70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。质粒上的遗传基因控制。u典型鼠疫菌培养典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h以上菌落在透过光线
5、下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边。花边。8鼠疫噬菌体试验在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线自然流下，置20培养24h,有明显的噬菌带。在1822鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。
6、鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右即可获得结果。分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫菌。9鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验典型鼠疫菌菌落形态噬菌带10鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验鼠疫菌培养特征鼠疫噬菌体试验11三、鼠疫F1抗原、抗体检测鼠疫F1抗原检测1.反向血球凝集试验(RIHA)2.酶联免疫吸附试验(ELISA)3.胶体金免疫层析法(GICA)4.免疫荧光技术(IFT)鼠疫F1抗体检测1.间接血球凝集试验(IHA)2.酶联免疫吸附试验(ELISA)3.胶体金免疫层析法(GICA)12间接红血球凝集试验(IHA)鼠疫菌特异性F1抗原致敏
7、经单宁酸鞣化处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试验方法和结果判定均为常规操作。IHA微量法结果：13反向血球凝集试验(RIHA)用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。RIHA微量法结果：14酶联免疫吸附试验(ELISA)测抗体测抗体.双抗原夹心法：双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，抗原包被反应板，加入待测标本加入待测标本28反应反应1.5h洗板，洗板，加入加入HRP-F1抗原抗原28反应反应1h洗板，洗板，加入底物加入底物OPD蔽光反应蔽光反应30min后加后加终止液终止液(2mol/L硫酸硫酸)。间接法：间接法：已知已
8、知F1抗原包被反应板，抗原包被反应板，加标本加标本37反应反应1h洗板，加入酶标洗板，加入酶标二抗二抗37反应反应1h洗板，加入底物洗板，加入底物(如如OPD或或TMB)蔽光反应蔽光反应30min显显色后加终止液。色后加终止液。用肉眼观察结果并用酶标仪检测每用肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值孔的吸光度值(A)测抗原双单抗夹心法：双单抗夹心法：F1-McAb包被反应包被反应板，加入标本板，加入标本28反应反应1.5h洗板，加洗板，加入入HRP-F1McAb 28反应反应1h洗板，洗板，加入底物加入底物OPD蔽光反应蔽光反应30min后加终后加终止液。止液。双抗体夹心法双抗体夹心法(改良法
9、改良法-美国美国CDC鼠疫鼠疫诊断技术实验室操作手册诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫：鼠疫免疫血清特异性抗体血清特异性抗体(F1Ab)包被反应板，包被反应板，加标本加标本37反应反应1h洗板，加小鼠洗板，加小鼠F1McAb 液液37静置静置1h洗板，加洗板，加HRP标记的羊抗小鼠标记的羊抗小鼠IgG 37反应反应1h洗板洗板,加底物加底物OPD蔽光反应蔽光反应30min显色，显色，加终止液。加终止液。肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值吸光度值(A)15胶体金免疫层析法(GICA)检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以GICA广泛用于实践。基本原理均为夹心
10、法。双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗(F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另一株单抗(金标-F1McAb)显色。双抗原夹心法测抗体：双抗原夹心法测抗体：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+标本中待测抗体(F1Ab)+金标记的F1抗原(金标-F1Ag)显色。夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫固定于膜上的鼠疫F1抗原标抗原标本中的相应抗体金标记的本中的相应抗体金标记的SPA显色。显色。16GICA双抗体夹心法测抗原G区：金标特异性抗体(鼠型F1McAb)C区：羊抗小鼠IgT区：特异性单克隆抗体(F1McAb)吸水纸标本标本17免疫荧光技术(IFT)标记物-荧光素(如异硫氰
11、荧光素FITC)荧光素标记抗体检测相应抗原-直接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰为异硫氰酸荧光黄标记鼠疫酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。单克隆抗体。方法：固定好的玻片标本用方法：固定好的玻片标本用1%牛牛血清血清PBS浸洗浸洗5分钟，流水冲洗。分钟，流水冲洗。用用FITC-FIMcAb适量（适量（0.2ml）荧）荧光染色，室温作用光染色，室温作用30分钟，流水分钟，流水冲洗。干燥，荧光显微镜油镜观冲洗。干燥，荧光显微镜油镜观察，鼠疫菌染上翠绿色荧光察，鼠疫菌染上翠绿色荧光Yersinia pestis 免疫荧光染色Fluorescence antibody positivity is se
12、en as bright,intense green staining around the bacterial cell 18鼠疫菌特异性基因片断检测PCR目标基因：鼠疫菌的目标基因：鼠疫菌的fra和和pla特异性基因片段特异性基因片段引物序列和扩增产物的长度引物序列和扩增产物的长度目标基因目标基因 引物序列引物序列 产物长度产物长度 fra 1F 5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3 249 bp 1R 5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3 pla 2F 5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3 456 bp 2R 5-GTGACATAATATC
13、CAGCGTTAATT-3内部对照：以鼠疫菌内部对照：以鼠疫菌EV株株DNA为模板，采用上述为模板，采用上述f1引物扩引物扩增出增出fra基因基因249 bp片段，再以片段，再以16SrRNA基因引物：基因引物：F 5-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3 R 5-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3 扩增出扩增出16SrRNA基因基因396bp片段加载体重组而成，产物片段加载体重组而成，产物长度长度645 bp，使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。，使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。应用多重应用多重PCR方法来检测鼠疫菌，所选取的扩增区域都为鼠方法来检测鼠疫菌，所选
14、取的扩增区域都为鼠疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具有较高特异性。有较高特异性。19鼠疫PCR反应体系PCR反应体系反应体系(总量总量25l)采用其它总量时，采用其它总量时，下列配方按比例改变。下列配方按比例改变。无菌去离子水无菌去离子水 13.5l10反应缓冲液反应缓冲液 2.5l4dNTP混合物（每种混合物（每种2.5mM）2l引物（引物（1F、1R、2F、2R）各各1l 内部对照模板内部对照模板(IC)1l待测标本待测标本 1lTaq DNA 聚合酶聚合酶 1l20鼠疫PCR反应条件反应条件(扩增扩增)：预变性预变性9
15、5 5min，1个循个循环；然后环；然后95 1 min，55 1 min，72 1 min，30个循环；最后个循环；最后72 5 min。共。共1小时小时40分。分。电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂5l，混均短，混均短暂离心。胶体的每一孔中加入上述处理的反暂离心。胶体的每一孔中加入上述处理的反应产物应产物8l，在，在80-100V(不超过不超过5V/cm)电压电压下下TBE缓冲液中电泳约缓冲液中电泳约1小时。凝胶成像仪读小时。凝胶成像仪读取结果并照相。取结果并照相。21多重PCR扩增结果鼠疫PCR 内部对照质粒与不同浓度EV菌 PCR扩增结果 鼠疫多重PCR 多重PC
16、R扩增结果22鼠疫菌质粒检测鼠疫菌的三个寻常质粒：pPCP1 6Mda(9.5kb)编码鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞浆素原活化因子；pCD145 Mda(70kb)编码型分泌系统的质粒，即主要编码低钙反应并表达LrcV及一系列耶尔森菌特有的Yops；pMT1 65Mda(100kb)编码F1抗原和鼠毒素。91001全基因组测序新发现的质粒：pCRY长度21742bp，具有独立复制能力，有一群编码型分泌系统的基因。质粒DNA提取-碱裂解法和热裂解法质粒电泳分析23鼠疫菌研究进展u传统的病原体分类传统的病原体分类(classification)和鉴定和鉴定(identification)方法
17、方法:病原体的形态特征病原体的形态特征生长特征生长特征(培养特性培养特性)血清学反应血清学反应生化特征生化特征u基因分类基因分类(Genotyping)和鉴定方法和鉴定方法:多是基于多是基于PCR和核酸凝胶电泳技术，通过电泳条带模式比和核酸凝胶电泳技术，通过电泳条带模式比较分析，揭示基因组成间差异。较分析，揭示基因组成间差异。AFLP扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性 RFLP限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性PFGE脉冲电场凝胶电脉脉冲电场凝胶电脉 RAPD随机扩增多态随机扩增多态DNA RepPCR基因组重复序列基因组重复序列PCR技术技术 Southern Blotting核酸探针杂交技术核酸探针杂交技术(核酸印迹试验核酸印迹试验)ARDRA 扩增的扩增的rDNA限制酶切分析技术限制酶切分析技术 DNA序列分析和全细菌可溶性蛋白质电泳技术等；序列分析和全细菌可溶性蛋白质电泳技术等；生物芯片技术。生物芯片技术。u鼠疫菌全基因组学与鼠疫菌微进化鼠疫菌全基因组学与鼠疫菌微进化2425
