1、第九讲凝胶电泳技术ppt 凝胶电泳凝胶电泳(gel electrophoresis)技术技术 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 蛋白分子杂交技术蛋白分子杂交技术 细胞转化（原核）细胞转化（原核）/转染（真核）转染（真核）PCR PCR扩增扩增 DNA DNA测序测序DNA测序仪 蛋白测序蛋白测序 文库构建文库构建 酵母双杂交酵母双杂交4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好（常用）。DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素
2、均匀地标记，使得标记的DNA具有较高的放射比活性。应用直接酶切，回收DNA分子；RNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移率要快；但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的DNA具有较高的放射比活性。应用直接酶切，回收DNA分子；电泳条件大片断低电压长时间，小片段高电压短时间
3、5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。RNARNA干扰干扰(RNAi):):转录后基因沉默技术转录后基因沉默技术 第一节第一节 凝胶电泳技术凝胶电泳技术 凝胶电泳（凝胶电泳（Gel electrophoresis）是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于
4、分析用途。形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。一、核酸的凝胶电泳一、核酸的凝胶电泳 基本原理基本原理 在在buffer为为PH8.0时，带有时，带有负电荷的负电荷的 DNA或或RNA核苷核苷酸链，依靠无反应活性的稳定介质（酸链，依靠无反应活性的稳定介质（琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶或或聚丙烯聚丙烯酰胺酰胺凝胶）和缓冲液，凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率在电场中以一定的迁移率从负极移从负极移向正极向正极。
5、根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。分彼此分开。电泳槽电泳槽电泳仪电泳仪梳子梳子电泳槽电泳槽制胶板制胶板正极电正极电源插孔源插孔负极电负极电源插孔源插孔电源线电源线电泳槽电泳槽(2)随机引物标记法：4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。一 Southern杂交凝胶电泳通常用于分析用途。染色和观察溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，3、DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电
6、场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。3、DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的DNA具有较高的放射比活性。一 Southern杂交7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.分子杂交(molecule hybridization)如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现
7、相同的DNA图谱,则为同一种DNA。凝胶电泳的分辨力根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，及由此演化的斑点杂交和菌落杂交等。聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间电泳条件大片断低电压长时间，小片段高电压短时间在65 下将LMP琼脂糖凝胶熔化；二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素加DNA样品1g，指示剂 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型 分子量较小的分子量较小的DNA分子比分子量较大的分子比分子量较大的DNA分子分子迁移率要快迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，同等分子量的不同构型
8、的核酸分子，构型紧密的构型紧密的比线性比线性DNA分子要快分子要快，线性线性DNA分子比开环分子比开环DNA分分子要快。子要快。图2 线性DNA电泳图 凝胶电泳的分辨力凝胶电泳的分辨力 与凝胶的类型和密度相关与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在琼脂糖凝胶的分辨力在0.20.250Kb50Kb之间之间;聚丙烯酰胺的分辨力在聚丙烯酰胺的分辨力在1 11000bp1000bp之间之间聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分辨率，分辨率，1bp1bp差异可区分）差异可区分）琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多
9、糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖常熔点的琼脂糖和低熔点（低熔点（LMP）琼脂糖琼脂糖。LMP琼脂糖琼脂糖 熔点熔点6265 熔解后，在熔解后，在37 可保持液态数小时；可保持液态数小时；在在25 可保持液态约可保持液态约10min 应用直接酶切，回收应用直接酶切，回收DNA分子；分子；在在65 下将下将LMP琼脂糖凝胶熔化；琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提加入过量的酚抽提DNA；离心获得含离心获得含DNA分子的上清液。分子的上清液。琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图 琼脂糖凝胶电泳的参数琼脂糖凝胶电泳的参数 缓冲液缓冲液1 TAE或或TBE 凝胶的含量根据检测的凝胶的含量根据检测的DNA大小大小 加
10、加DNA样品样品1g，指示剂，指示剂 电泳条件大片断低电压长时间，小片段高电泳条件大片断低电压长时间，小片段高电压短时间电压短时间 染色和观察溴化乙锭（染色和观察溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，）染色，在在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到仪）。能看到0.05 g的微量的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比的片断大小与荧光强度成正比 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15。如在电泳鉴定质粒纯度
11、时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。酶法也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸(NTP或dNTP)分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。在核酸分子杂交实验中标记探针时多采用此法。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。随机引物(randomprimer)是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析的生物基因
12、组DNA 6核苷酸排列的多种可能性而设计的。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受
13、阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的DNA具有较高的放射比活性。TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好（常用）。随机引物(randomprimer)是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析的生物基因组DNA 6核苷酸排列的多种可能性而设计的。用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算体外标记法分为化学法和酶法7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线
14、性关系。Low Geling Agarose 4-6 0.2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。TAE:电泳大于电泳大于13kb的片段时用的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分缓冲液将取得更好的分离效果。离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电，并且当用于电泳小于泳小于1kb的片段时分离效果更好的片段时分离效果更
15、好（常用）（常用）。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。片段的电泳中使用。电泳反冲液电泳反冲液Separation Range Vs.%Agarose Low Geling Agarose 4-6 0.02-0.4注意：注意：EB（Ethidium bromide，溴化乙锭）为强致癌物！，溴化乙锭）为强致癌物！Agarose gel electrophoresis凝胶成像仪凝胶成像仪 用已知分子量的标准用已知分子量的标准DNA对对DNA片断大小的估算片断大小的估
16、算 二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素琼脂糖主要在琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性在中性pH值值下带负电荷的下带负电荷的DNA向阳极迁移向阳极迁移,其迁移速率由下列多其迁移速率由下列多种因素决定种因素决定:1、DNA的分子大小的分子大小:线状双链线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁
17、移得越力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。慢。2、琼脂糖浓度琼脂糖浓度一个给定大小的线状一个给定大小的线状DNA分子分子,其迁移速度在不同其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于分子的大小。分离小于0.5kb的的DNA片段所需胶浓片段所需胶浓度是度是1.2-1.5%,分离大于分离大于10kb的的DNA分子所需胶浓度为分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为片段大小间于两
18、者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。3、DNA分子的构象分子的构象 当当DNA分子处于不同构象时分子处于不同构象时,它在电场中移动距离它在电场中移动距离不仅和分子量有关不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的是不一样的,超螺旋超螺旋DNA移动快移动快,而线状双链而线状双链DNA移动要移动要慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其不同构象引起还是
19、因为含有其他他DNA引起时引起时,可从琼脂糖凝胶上将可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收带逐个回收,用用同一种限制性内切酶分别水解同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳然后电泳,如在凝胶上出如在凝胶上出现相同的现相同的DNA图谱图谱,则为同一种则为同一种DNA。4、电源电压电源电压 在低电压时在低电压时,线状线状DNA片段的迁移速率与所加电片段的迁移速率与所加电压成正比。压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量但是随着电场强度的增加，不同分子量的的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大因场强升高引起的迁移率升高
20、幅度也越大,因此电压因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于于2kb的的DNA片段的分辨率达到最大片段的分辨率达到最大,所加电压不得所加电压不得超过超过5v/cm。5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状环状DNA，使其刚性更强，使其刚性更强,还会还会使线状使线状DNA迁移率降低迁移率降低15。6、离子强度影响离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳
21、缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳的电泳迁移率。在没有离子存在时迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小，电导率最小，DNA几乎不移动几乎不移动，在高离子强度的缓冲，在高离子强度的缓冲液中液中(如误加如误加10电泳缓冲液电泳缓冲液),则则电导很高并明显产热电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或DNA变性变性。第二节第二节 分子杂交分子杂交 一一 Southern杂交杂交二二 Northern杂交杂交三三 菌落原位杂交菌落原位杂交四四 Western杂交杂交分子杂交分子杂交(molecule hybridization)【分
22、子杂交】是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析【分子杂交】是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。根据其检测对象的不同可分为根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、杂交、Northern 杂杂交和交和 Western 杂交杂交，及由此演化的斑点杂交和菌落杂交等。，及由此演化的斑点杂交和菌落杂交等。分子杂交可在分子杂交可在DNA与与DNA、RNA与与RNA或或RNA与与DNA的的二条单链之间
23、进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。【核酸分子杂交】是指核酸分子【核酸分子杂交】是指核酸分子(DNA或或RNA)在变性以后，在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。合双链的过程。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的的DNA或或RNA分子所处的位置。分子所处的位置。探针标记方法探针标记方法 体内体
24、内(in vivo)标记是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到标记是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到活细胞培养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新活细胞培养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新合成的核酸分子中去。合成的核酸分子中去。体外标记法分为化学法和酶法体外标记法分为化学法和酶法 化学法。最常用的是化学法。最常用的是125I标记和光敏生物素标记和光敏生物素(photobiotin)标标记。记。酶法也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸酶法也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸(NTP或或dNTP)分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人分子上，然后利用酶促反应将标
25、记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。分子上。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。分子杂交(molecule hybridization)染色和观察溴化乙锭（ethidium bromide，E
26、B）染色，但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素电泳条件大片断低电压长时间，小片段高电压短时间凝胶电泳的分辨力根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。一 Southern杂交DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15。RNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术TAE的缺
27、点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。酶法也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸(NTP或dNTP)分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素【核酸分子杂交】是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。凝胶电泳(gel electrophoresis)技术随机引物(randomprimer)是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析的生物基因组DNA
28、6核苷酸排列的多种可能性而设计的。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。(1)缺口平移法：缺口平移法：DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的均匀地标记，使得标记的DNA具有较高的放射比活性。具有较高的放射比活性。3种三磷酸脱氧核糖核苷酸如种三磷酸脱氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dGT
29、P，一种核素标记的，一种核素标记的核苷酸核苷酸32PdCTP，待标记，待标记DNA片段。片段。在极微量在极微量DNA聚合酶的作用下，在双链聚合酶的作用下，在双链DNA分子的一条链上随机切开分子的一条链上随机切开若干个缺口而不是切断若干个缺口而不是切断DNA或将其降解，然后，大肠杆菌或将其降解，然后，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I在切口的在切口的3OH端逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有端逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有5，3外外切酶的活性，它同时切除切酶的活性，它同时切除5，端游离的核苷酸，端游离的核苷酸，3端核苷酸的加入和端核苷酸的加入和5，端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着端核苷酸的切
30、除同时进行导致切口沿着DNA链移动。链移动。(2)随机引物标记法：随机引物(randomprimer)是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计它们的顺序是根据计算机分析的生物基因组算机分析的生物基因组DNA 6核苷酸排列的多种可能性而核苷酸排列的多种可能性而设计的设计的。对于任意一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些6核苷酸片段可以与之结合，起到起到DNA合成合成引物的作用引物的作用。将这些随机引物与变性后的DNA单链结合，然后以此结合的随机引物为引物，以变性后的DNA单链为模板，在Klenow酶的催化下，以4种dNTP(其中一种为标记的dNT
31、P)为底物，合成与探针DNA互补的且带有标记物的DNA探针。在核酸分子杂交实验中标记探针时多采用此法。在核酸分子杂交实验中标记探针时多采用此法。7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.RNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术凝胶的含量根据检测的DNA大小根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。加DNA样品1g，指示剂一 Southern杂交电泳条件大片断低电压长时间，小片段高电压短时间琼脂糖凝胶的分辨力在0.DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的DNA具有较高的放射比活
32、性。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。琼脂糖凝胶的分辨力在0.熔点62655kb的DNA片段所需胶浓度是1.应用直接酶切，回收DNA分子；Low Geling Agarose 4-6 0.4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。RNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.3种三磷酸脱氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dG
33、TP，一种核素标记的核苷酸32PdCTP，待标记DNA片段。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比线性DNA分子要快，线性DNA分子比开环DNA分子要快。熔点6265熔解后，在37 可保持液态数小时；分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移率要快；7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.染色和观察溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率
34、将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素琼脂糖凝胶的分辨力在0.电泳条件大片断低电压长时间，小片段高电压短时间TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。体内(in vivo)标记是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到活细胞培养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新合成的核酸分子中去。最常用的是125I标记和光敏生物素(photobiotin)标记。熔点62652、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
