1、第十五章第十五章 遗传性疾病的分子诊断遗传性疾病的分子诊断 基因工程研究所南方医科大学南方医科大学教学目的与要求教学目的与要求 了解了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷分子诊断的适应症。（包括胚胎植入前）遗传缺陷分子诊断的适应症。熟悉熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。掌握掌握遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。缺陷的经典检测方法及临床意义。重点重点遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传遗传性疾病及产前（包括胚胎
2、植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。缺陷的经典检测方法及临床意义。难点难点遗传性疾病的分子机制。遗传性疾病的分子机制。南方医科大学本章目录本章目录n第一节第一节 遗传性疾病分子诊断的策略遗传性疾病分子诊断的策略*n第二节第二节 遗传病的分子诊断遗传病的分子诊断n第三节第三节 产前（包括胚胎植入前）遗传缺产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断陷的分子诊断*南方医科大学第一节第一节 遗传性疾病分子诊断的策略遗传性疾病分子诊断的策略*n一、直接诊断策略一、直接诊断策略n二、基因多态性连锁分析二、基因多态性连锁分析n三、基因突变的定量（三、基因突变的定量（dosage）诊断）诊断 南方医科大学
3、一、直接诊断策略一、直接诊断策略定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变类型：点突变类型：点突变 缺失缺失 插入插入 倍增倍增前提：基因已经克隆，序列和结构清楚前提：基因已经克隆，序列和结构清楚南方医科大学(一)点突变的诊断1、基因背景清楚的点突变基因背景清楚的点突变n等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide,ASO)nPCR-ELISAn等位基因特异性扩增(allele specific amplification,ASAnPCR-RFLPn测序n基因芯片技术等进行诊断南方医科大学2、基因背景未知的
4、点突变n单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)n变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)n异源双链分析(heteroduplex analysis,HA)nDNA序列测定n蛋白截短测试（protein truncation test,PTT）南方医科大学(二)片段性突变的检测（1）少数核苷酸缺失或插入 检测点突变的方法（2）大的片段突变 Southern印迹技术、多重PCR技术。片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变，碱基的缺失、插入、扩增和重组。南方医
5、科大学二、基因多态性连锁分析二、基因多态性连锁分析检测原理检测原理：多态性连锁分析、关联分析检测前提检测前提：致病基因尚未被定位和阐明基因太大突变种类太多检测方法检测方法：RFLP，VNTR，STR，SNP南方医科大学三、基因突变的定量诊断三、基因突变的定量诊断检测方法检测方法：细胞分裂中期染色体检测 固相杂交 PCR 扩增检测内容检测内容：大范围的重复、缺失南方医科大学方法方法分辨率分辨率(碱基数碱基数)说明说明细胞分裂中期染色体检细胞分裂中期染色体检测测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH5 x 106细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交；FISH5 x 104用修饰（如
6、纤维探针）来增强分辨率；阵列阵列CGH5 x 104使用阵列化的细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs）而非细胞分裂中期染色体作为探针；MAPH不确定将探针与基因组DNA杂交，然后再扩增探针；微卫星微卫星PCR1 x 102取决于缺失区已知的微卫星；差异差异PCR1 x 102要求精心控制起始DNA的质和量，结果为相对量，是一种半定量方法；竞争竞争PCR1 x 102准确，结果为摩尔数，是一种绝对定量方法；Real-time PCR1 x 102成本较高，可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBR Green染料或探针，应用越来越
7、广泛；长片段长片段 PCR1 x 102检测基因内缺失比重复更有效，可以确定突变的性质。南方医科大学第二节第二节 遗传病的分子诊断遗传病的分子诊断n一、血红蛋白病一、血红蛋白病n二、血友病二、血友病n三、肌营养不良症三、肌营养不良症n四、苯丙酮尿症四、苯丙酮尿症n五、囊性纤维化五、囊性纤维化n六、亨廷顿病六、亨廷顿病n七、脆性七、脆性X综合征综合征南方医科大学一、血红蛋白病一、血红蛋白病血红蛋白具有血红蛋白具有4个亚个亚基组成的四级结构，基组成的四级结构，每每个亚基可结合个亚基可结合1 1个血红素个血红素并携带并携带1 1分子氧分子氧。Hb亚基之间通过亚基之间通过8对盐键，使对盐键，使4个亚基
8、紧密个亚基紧密结合而形成亲水的球状结合而形成亲水的球状蛋白。蛋白。南方医科大学 珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇16p13.33-p13.11南方医科大学11 15.5南方医科大学血红蛋白的类型血红蛋白的类型成人成人Hb Hb：HbHb A A 2 2 2 2 979798%98%HbHb A A2 2 2 2 2 2 2 23 3%胎儿胎儿HbHb：Hb F Hb F 2 2 2 2 2 2G G2 2 2 2A A2 2胚胎胚胎HbHb：Hb Gower Hb Gower 2 2 2 2 2 2G G2 2 2 2A A2 2 (妊娠妊娠1212周内周内)Hb Gower Hb Gower 2 2
9、 2 2 Hb Portland Hb Portland 2 2 2 2 南方医科大学南方医科大学血红蛋白病血红蛋白病hemoglobinopathy n结构异常血红蛋白病结构异常血红蛋白病 镰刀状细胞贫血；不稳定血红蛋白病 血红蛋白M病 氧亲和力改变n地中海贫血，地中海贫血，珠蛋白的合成降低或消失南方医科大学1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞n镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。南方医科大学N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr
10、pro val glu C(146)镰刀状细胞贫血分子机制镰刀状细胞贫血分子机制 GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAGGTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG南方医科大学分子诊断方法分子诊断方法限制性内切酶法（RE）ASOARMS、跨越断裂点的PCR(裂口PCR、gap-PCR)南方医科大学S 肽链肽链A肽链肽链 ACT CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法法 (Southern Blot)MstII CC TNA GG GG ANT CC1.15 kb0.2 kb1.35 kbASSA南方医科大学S 肽链肽链A肽链肽链 ACT CCT G
11、AG GAGACT CCT GTG GAGRE法法 (PCR-RFLP)DdeI C TNA G G ANT C268 bpASSA175 bp175268 443南方医科大学思考题（作业）n书中239页中关于HbE检测请回答下列问题n（1）HbE的突变碱基改变情况n (2)该突变位于蛋白质的第几个氨基酸n（3）突变位点位于氨基酸哪一个外显子上n（4）写出基因组参考序列中此外显子后的内含子序列（5和3端各5个碱基）n (5)用MnlI酶切后，请列出各种可能的情况n（6）结合所学习的知识，请再写出几种可能用于诊断的方法。南方医科大学 2.地中海贫血地中海贫血 n由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一
12、类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。n类型：n地中海贫血，n 地中海贫血，n 地中海贫血，n 地中海贫血，以此类推。南方医科大学地地 中中 海海 贫贫 血血南方医科大学地中海贫血地中海贫血 每条每条1616号染色体上有两个号染色体上有两个GeneGene缺失程度缺失程度不同，不同，链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型的地贫。的地贫。n若一条染色体上缺失一个若一条染色体上缺失一个基因基因（）为为+地贫地贫，链合成减少。链合成减少。n若一条染色体上两个若一条染色体上两个基因均缺失基因均缺失（）为为0 0地贫地贫，链不能合成。链不能合成。南方医科大学临床类型临床
13、类型类类 型型症症 状状正常人正常人静止型静止型+地贫杂合子地贫杂合子无症状无症状轻轻 型型（标准型）（标准型）0 0地贫杂合子地贫杂合子轻度贫血轻度贫血+地贫纯合子地贫纯合子血红蛋白血红蛋白H H病病 0 0地贫和地贫和+地地贫双重杂合子贫双重杂合子溶血性贫血溶血性贫血Hb BartsHb Barts胎胎儿水肿综合征儿水肿综合征 0 0地贫纯合子地贫纯合子胎儿水肿胎儿水肿南方医科大学胎胎 儿儿 水水 肿肿 南方医科大学地贫的分子基础地贫的分子基础 n依依基因缺陷程度分为：基因缺陷程度分为：1 1GeneGene缺失型（缺失缺失型（缺失1 1个个基因）基因）2 2非非GeneGene缺失型（点
14、突变）：无义突变、移码突变、缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等终止密码突变、剪接突变等结果结果 1 1 生成无功能或稳定性降低的生成无功能或稳定性降低的mRNAmRNA 无义突变无义突变 移码突变移码突变 终止密码突变终止密码突变 起始密码突变起始密码突变 2 2 RNARNA加工突变加工突变 3 3 产生不稳定产生不稳定HbHb南方医科大学n地中海贫血的分子机制 南方医科大学分子诊断方法分子诊断方法 n(1)PCR法 PCR 法已经成为鉴别缺失型 地中海贫血的首选方法。n(2)ARMS法 该法能快速鉴别诊断HbC S和HbQ Sn(3)ASA法 与ARMS 法相类
15、似n(4)SSCP法 非缺失型2 地中海贫血突变n(5)等位基因特异性扩增技术(ASPCR）法南方医科大学地中海贫血地中海贫血 珠蛋白珠蛋白Gene Gene 突变或缺失突变或缺失珠蛋白链合成速珠蛋白链合成速率下率下 降降溶血性贫血溶血性贫血 0 0 地贫地贫：链完全不能合成链完全不能合成 +地贫地贫：链可部分合成链可部分合成南方医科大学-地中海贫血临床分类地中海贫血临床分类临临 床床 类类 型型基基 因因 型型基基 因因 产产 物物临临 床床 表表 现现重型重型 地贫地贫+/+、0 0/0 0 0 0/0 0、+/0 0 链几乎不能合成链几乎不能合成 链合成相对增加链合成相对增加Hb FHb
16、 F和和Hb AHb A2 2增高增高地中海贫血面容地中海贫血面容溶血性贫血（需溶血性贫血（需输血）输血）轻型轻型 地贫地贫+/A A、0 0/A A0 0/A A能合成适量的能合成适量的 链链贫血不明显或轻贫血不明显或轻度贫血度贫血中间型中间型 地地贫贫+/+链部分合成链部分合成介于重型和轻型介于重型和轻型之间（不需输血）之间（不需输血）遗传性胎儿遗传性胎儿血红蛋白持血红蛋白持续增多症续增多症缺失或突变缺失或突变 链和链和 链合成受抑制链合成受抑制 链合成明显增加链合成明显增加成人成人Hb FHb F持续增持续增加，无症状加，无症状南方医科大学患儿颅骨及面颊部骨骼增大，头颅变大，额部隆起，颧
17、高，鼻梁塌陷，两眼距离增宽，眼睑浮肿，形成地中海贫血的特殊面容。南方医科大学X线颅骨照片可见颅骨内外板变薄，板障增宽，在骨皮质间出现垂直短发样骨刺南方医科大学-地中海贫血的分子基础地中海贫血的分子基础 地中海贫血已发现地中海贫血已发现100100多种突变类型，包括点突变和多种突变类型，包括点突变和 基因缺失。基因缺失。绝大多数绝大多数 地中海贫血是由于地中海贫血是由于 基因发生点突变所致，突基因发生点突变所致，突 变涉及基因内及侧翼序列。变涉及基因内及侧翼序列。（1 1）编码区突变）编码区突变（2 2）非编码区突变）非编码区突变（3 3）启动子区突变）启动子区突变（4 4）RNARNA裂解信号
18、突变裂解信号突变（5 5）加帽位点单个碱基突变）加帽位点单个碱基突变南方医科大学编码区突变编码区突变 mRNA稳定性降低或形成无功能稳定性降低或形成无功能mRNA（1）无义突变）无义突变 密码子密码子17：AC 密码子密码子43：GT 0 地贫地贫（2）移码突变）移码突变 密码子密码子71/72：+A 密码子密码子41/42：TCTT 0 地贫地贫（3）起始密码突变）起始密码突变 ATGAGG 0 地贫地贫南方医科大学 内含子内含子I I G GTTA AT T丧失一个剪切信号。丧失一个剪切信号。新的切点产生新的切点产生 同义突变同义突变激活激活II和和 ExonExon隐蔽裂解位点隐蔽裂解位
19、点 如：如：G GGTGTAGAGT T 产生新的剪切点产生新的剪切点非编码区突变非编码区突变 影响影响mRNA剪切、加工过程剪切、加工过程南方医科大学GTATGGTAGTGGTAGT，激活隐蔽剪切位点，激活隐蔽剪切位点南方医科大学启动子区突变启动子区突变 降低降低mRNA的转录效率的转录效率-28-28位位AG AG 突变破坏了突变破坏了TATA BoxTATA Box。南方医科大学RNA裂解信号突变裂解信号突变 不能准确裂解和加不能准确裂解和加polyA珠蛋白基因珠蛋白基因 3侧翼序列中侧翼序列中AATAAAAACAAA加帽位点单个碱基突变加帽位点单个碱基突变 不能准确裂解和加不能准确裂解
20、和加polyA加帽位点发生加帽位点发生AC颠换，影响转录效颠换，影响转录效率。通常是率。通常是mRNA的第一个核苷酸。的第一个核苷酸。南方医科大学分子诊断方法分子诊断方法 nPCR反向点杂交(PCR-RDB)法nPCRRFLP法n基因芯片法等 ND1234658710911南方医科大学 二、血友病二、血友病 人体的凝血过程需要多种凝血因子参加。由于凝血因子基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺如即造成血友病(hemophilia)。85 的血友病患者是由于血浆中缺乏凝血第8 因子(F)所致，约10的患者是由于缺乏凝血第9 因子(F)，前者称为甲型血友病，后者称为乙型血友病。南方医科大学
21、（一）甲型血友病及其分子诊断（一）甲型血友病及其分子诊断n甲型血友病是由于凝血因子(F)即抗血友病球蛋白(antihemophilic globulin,AHG)缺乏所导致的凝血机制异常的遗传性疾病。南方医科大学 2甲型血友病的分子机制 在F 基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A基因位于F基因的第22 号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1 基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起F基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致F 功能完全丧失而发生严重的血友病。南方医科大学甲型血友病分子诊断（1）基因倒位的检测 由于50左右
22、的甲型血友病是由于F 基因中的22 号内含子倒位引起的，所以检测该突变成为对患者进行基因诊断的首选方法。在检测基因倒位的方法中首选的是长距离PCR(LD-PCR)技术。南方医科大学(2)非基因倒位的检测 点突变是非基因倒位引起甲型血友病的主要原因，因此对该类患者的家系分析和携带者的基因检测主要是通过点突变的检测技术进行。南方医科大学n1)PCR-RFLP法 n2)VNTR法 n3)STR法 n4)PCR-SSCP法 南方医科大学（二）乙型血友病及其分子诊断（二）乙型血友病及其分子诊断n乙型血友病，又称Christmas 病或血浆凝血活酶成分(plasma thromboplastin comp
23、onent,PTC)缺乏症，是凝血因子(F)缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。南方医科大学分子机制n为编码F基因缺陷，导致F含量缺乏或结构异常，从而凝血功能障碍。临床表现与甲型血友病完全相似。南方医科大学分子诊断 n直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)；n间接检测方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱(dideoxy fingerprint,ddF)、变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）南方医科大学三、肌营养不良症三、
24、肌营养不良症 肌营养不良症又称为假性肥大性肌营养不良。主要有杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)和贝氏肌营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)，它们是一种常见的X连锁性隐性遗传病，因此患者都为男孩。南方医科大学发病机制 主要为抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene)的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)发生结构和功能的改变所致。Dystrophin 是抗肌萎缩蛋白基因(DMD基因)的产物，当DMD 基因突变后Dystrophin 合成缺乏，该复合物无法有效形成，使细胞膜不稳定，最终造成
25、肌细胞因通透性增加而变性或坏死，导致DMD 的发生。南方医科大学 2杜氏和贝氏肌营养不良症的杜氏和贝氏肌营养不良症的分子诊断分子诊断(1)多重PCR技术（2）短串联重复序列(short tandem repeat,STR)连锁分析（3）定量PCR技术（4）RT-PCR技术 南方医科大学四、苯丙酮尿症四、苯丙酮尿症nPKU是由挪威科学家Folling 发现的，当时被命名为“苯丙酮尿性智力发育不全”，1937 年Penrose 和Quastel 将之命名为苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)。其主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase,PAH
26、）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病。南方医科大学(二)苯丙酮酸尿症的分子诊断1PCRSTR 连锁分析 2PCR-SSCP法3PCR-RFLP 4多重ASPCR法 南方医科大学 五、囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)nCF是由囊性纤维化穿膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突变所致，为白种人中最常见一种家族常染色体隐性遗传性先天性致死性疾病，多累及儿童和青年，发病率以西、北欧及北美人群为高。CF常累及胃肠道和呼吸道，极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，
27、多数病人仅能成活数年到十余年。南方医科大学CF分子机制 nCFTR基因突变已达1000 余种，已知的CF突变在CFTR基因中的分布是非随机的，绝大多数集中于编码CFTR蛋白NBFs区的外显子9、10、11、12、19、20、21、22，跨膜区的外显子3、4、7、14a、14b、17b以及R区的第13 外显子，其中除F508 及另外十余种较为常见的突变外，其余均为罕见突变或仅见于个别病例。南方医科大学CF 分子诊断 早期CF的基因诊断基于RFLP连锁分析，采用的探针多为基因克隆过程中获得的基因侧翼DNA片段。在CF基因克隆和测序以后，PCR技术被用于直接基因诊断。同时，新的突变分析方法也相继问世
28、。南方医科大学 六、亨廷顿病六、亨廷顿病 亨廷顿病（Huntingtons disease,HD)是一种有IT 15 基因上CAG 重复序列一场扩展所致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征神经退行性的疾病。南方医科大学HD 分子机制 HD即由CAG重复序列的异常扩展突变引起，CAG 重复范围在正常的染色体为935个拷贝，而在HD 患者的染色体上，重复长度大于拷贝，CAG 的拷贝数目与HD的发病年龄负相关，其基因突变率在人类单基因遗传性疾病中最低。南方医科大学HD的分子诊断 n针对不同个体运用三条引物进行PCR 扩增，扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影鉴定IT 15 基因（CAG)串联重
29、复序列拷贝数，此法能对超过95HD 患者诊断和排除诊断。南方医科大学 七七 脆性脆性X综合征综合征 脆性X综合征（fragile X syndrome,FraX）是仅次于Downs 综合征的又一常见遗传性智力缺陷疾病。南方医科大学脆性X综合症 分子机制1FMR-1 基因5端(CGG)n 重复序列异常 2FMR-1 基因5端CpG岛的异常甲基化 3FMR-1 基因缺失 4FMR-1 基因点突变 南方医科大学脆性X综合征的分子诊断 1Southern印迹杂交法2PCR法3微卫星序列分析法南方医科大学第三节第三节 产前（包括胚胎植入前）产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断遗传缺陷的分子诊断n产前
30、诊断（产前诊断（prenatal diagnosis,PND）*就是在胎儿出生以前，通过对某些特异基因进行分析，以判断胎儿是否有某种遗传性疾病的手段。n植入前遗传学诊断（植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD）*主要是指在显微操作下从体外受精（in vitro fertilization,IVF）发育至68 个细胞期的胚胎中，活检12 个卵裂球细胞或直接获取受精前后的极体，通过PCR或FISH，进行快速遗传学诊断，选择正常胚胎植入宫内，从而获得健康胎儿。南方医科大学IVF 过 程南方医科大学南方医科大学 产前遗传缺陷的分子诊断内容产前遗传缺
31、陷的分子诊断内容n一、染色体异常分子诊断一、染色体异常分子诊断n二、单基因病的产前（植入前）分子诊断二、单基因病的产前（植入前）分子诊断南方医科大学 一、染色体异常分子诊断一、染色体异常分子诊断1荧光原位杂交2比较基因组杂交 3间期染色体转化 南方医科大学 二、单基因病的产前（植入前）分子诊断 1PND和PGD可诊断的单基因病 2PND 和PGD 诊断单基因病的分子诊断技术 （1）巢式PCR （2）全基因组扩增（WGA）（3）多重PCR （4）荧光PCR （5）突变分析法南方医科大学PND与PGD的适应证n可能孕严重遗传病、先天畸形胎儿的孕妇n有家族史n夫妇一方有染色体异常n服致畸药史、病毒感
32、染史n原因不明的多次流产、死胎等n胎儿发育迟缓n孕妇年龄超过35岁南方医科大学n整理有心做彻底，处处整齐好管理。23.1.1923.1.19Thursday,January 19,2023n安全管理完善求精，人身事故实现为零。16:18:5816:18:5816:181/19/2023 4:18:58 PMn风起云涌，人人出动，翻箱倒柜，拜访积极。23.1.1916:18:5816:18Jan-2319-Jan-23n观念身先，技巧神显，持之以恒，芝麻开门。16:18:5816:18:5816:18Thursday,January 19,2023n质量靠大家，情系你我他。23.1.1923.1
33、.1916:18:5816:18:58January 19,2023n优质产品，是市场竞争必胜的保证。2023年1月19日下午4时18分23.1.1923.1.19n把好质量关，效率翻一翻。2023年1月19日星期四下午4时18分58秒16:18:5823.1.19n巧干带来安全，蛮干招来祸端。2023年1月下午4时18分23.1.1916:18January 19,2023n安全规程高于上级命令。2023年1月19日星期四16时18分58秒16:18:5819 January 2023n提高企业效益的保证。下午4时18分58秒下午4时18分16:18:5823.1.19n消防进家园，平安到永远。23.1.1923.1.1916:1816:18:5816:18:58Jan-23n快刀不磨会生锈，安全不抓出纰漏。2023年1月19日星期四16时18分58秒Thursday,January 19,2023n运动从你我做起，让我们更有自信。23.1.192023年1月19日星期四16时18分58秒23.1.19谢谢大家！谢谢大家！
