1、流感疫苗生产及研究进展流感疫苗生产及研究进展 内容内容病毒性灭活疫苗概述1流感和流感病毒2流感疫苗生产工艺3 3流感疫苗研发流感疫苗研发4 4病毒性灭活疫苗概述 定义及分类病毒接种和培养病毒接种和培养采用物理或化采用物理或化学的方式将病学的方式将病毒灭活毒灭活其他的生其他的生产步骤产步骤成品成品培养基质培养基质流感疫苗：鸡胚流感疫苗：鸡胚出血热及森脑疫出血热及森脑疫苗：原代地鼠肾苗：原代地鼠肾细胞细胞狂犬疫苗：狂犬疫苗：Vero Vero 细胞细胞灭活方法：灭活方法：加热加热灭活剂（福灭活剂（福尔马林等）尔马林等）纯化：纯化全病纯化：纯化全病毒疫苗毒疫苗裂解：裂解疫苗裂解：裂解疫苗亚单位：亚单
2、位亚单位：亚单位疫苗疫苗纯化全病毒疫苗：纯化全病毒疫苗：冻干人用狂犬病冻干人用狂犬病疫苗疫苗出血热、森脑出血热、森脑-含氢氧化铝含氢氧化铝佐剂佐剂裂解：流感病毒裂解：流感病毒裂解疫苗裂解疫苗灭活疫苗：称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养灭活疫苗：称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持免疫原性，并的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。结合相应的佐剂而制成的疫苗。长春公司的病毒性灭活疫苗长春公司的病毒性灭活疫苗 工艺流程工艺流程名称名称病毒培养病毒培养病毒纯化病毒纯化
3、病毒裂解病毒裂解病毒灭活病毒灭活半成品配半成品配制及分包制及分包装装冻干人用狂犬病疫苗基质：Vero细胞培养方式：生物反应器超滤浓缩；柱层析（分子筛）无灭活剂：-丙内酯冻 干双价肾综合征出血热疫苗森林脑炎灭活疫苗基质：原代地鼠肾细胞方式：转瓶超滤浓缩；柱层析（分子筛）无灭活剂：甲醛含铝佐剂流感病毒裂解疫苗基质：鸡胚方式：孵化间超滤浓缩；蔗糖密度区带离心裂解剂：Triton X-100灭活剂：甲醛无硫柳汞两种灭活剂的比较简要介绍简要介绍灭活机理灭活机理优缺点优缺点甲醛甲醛甲醛，化学式甲醛，化学式HCHOHCHO，称，称蚁醛蚁醛。无色气体，有无色气体，有特殊的刺激气特殊的刺激气味，对人眼、味，对人
4、眼、鼻等有刺激作鼻等有刺激作用。用。既可作用于病毒含既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基氨基的核苷酸碱基（如（如A,G,UA,G,U），又可），又可作用病毒壳蛋白。作用病毒壳蛋白。1 1）病原体蛋白的抗原性严重破坏，）病原体蛋白的抗原性严重破坏，可能有病原体存活；可能有病原体存活；2 2）灭活时间长；）灭活时间长；3 3）易受温度、）易受温度、pHpH、浓度、是否存在、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响；因素影响；4 4）残留的游离甲醛，注入机体后，）残留的游离甲醛，注入机体后，会产生制激性反应。会产生制激性反应。-丙内丙内酯酯一种杂环类化一种杂环类
5、化合物合物(C3H4O2)(C3H4O2)，沸点沸点155155，常，常温下是无色粘温下是无色粘稠状液体，对稠状液体，对病毒具有很强病毒具有很强的灭活作用。的灭活作用。作用于病原体作用于病原体DNADNA或或RNARNA，改变病毒核酸，改变病毒核酸结构达到灭活目的，结构达到灭活目的，而不直接作用于蛋而不直接作用于蛋白。白。1 1）不破坏病毒的血凝素抗原）不破坏病毒的血凝素抗原,保持保持病毒良好的免疫原性；病毒良好的免疫原性；2 2）灭活时间短；）灭活时间短；3 3）其水解产物对机体无害，接种反）其水解产物对机体无害，接种反应轻。应轻。常用的裂解剂简要介绍简要介绍机理机理Triton X-100
6、Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚,是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。Triton N-101Triton N-101聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）溶解脂质CTABCTAB十六烷基三甲基溴化铵,阳离子表面活性剂，是一种阳离子去污剂与非离子及两性离子表面活性剂有良好的配位性，对多种油脂具较好的乳化作用,有轻微脱脂作用.流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病。常造成不同程度的流行，对人类的健康造成巨大的威胁。慢性病恶化、继发感染、其它-痛苦不
7、堪-缺课或缺勤-就医-使用抗生素-住院-死亡流感流感流感和流感病毒流感的流行特点 是在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行，局部暴发流行及散发。具有一定的季节性：温、寒带地区常在冬、春季节流行，但热带和亚热带地区任何季节都可以流行。流感病毒传播迅速、流行广泛、抗原易变异，人群的特异性免疫状况不稳定。发病率高，并伴有一定的死亡率。最高的为青少年，高危人群为年迈体弱或带有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中总要造成不同程度的超额死亡。流感患者和隐性感染者是流感的主要传染源。从潜伏期末到发病的急性期（约7天）都有传染性。死亡率升高超过一定的正常临界水平死亡率升高超过一定的正常
8、临界水平流感病毒形态结构流感病毒的超细微结构照片流感病毒的超细微结构照片流感病毒电镜照片流感病毒电镜照片流感病毒形态结构甲型流感病毒基因组各节段的大小与功能甲型流感病毒基因组各节段的大小与功能节段节段长度（长度（bp）编码蛋白）编码蛋白主要功能主要功能RNAI2341PB2RNA转录酶；识别和结合来源于宿主细胞的帽子转录酶；识别和结合来源于宿主细胞的帽子RNA22320PB1RNA转录酶主要成分；启动转录和转录酶主要成分；启动转录和RNA合成延伸合成延伸RNA32233PA具有解旋酶话性具有解旋酶话性RNA41778HA结合靶细胞受体，诱导病毒与靶细胞融合诱导中结合靶细胞受体，诱导病毒与靶细胞
9、融合诱导中和抗体，凝集红细胞和抗体，凝集红细胞RNA51565NP与基因组与基因组RNA结合，参与形成核糖核蛋白（结合，参与形成核糖核蛋白（RNP）颗粒颗粒RNA61413NANA活性；水解细胞多糖受体，协助新生病毒颗活性；水解细胞多糖受体，协助新生病毒颗粒从被感染宿主细胞表面游离下来，促使子代病粒从被感染宿主细胞表面游离下来，促使子代病毒释放毒释放RNA71027M1、M2病毒基质膜蛋白，有保护作病毒基质膜蛋白，有保护作用；质子通道作用用；质子通道作用RNA8890NS1、NS2非结构蛋白，抑制宿主细胞蛋白合成或参与非结构蛋白，抑制宿主细胞蛋白合成或参与vRNA合成合成 流感病毒的理化特性
10、流感病毒对热敏感，通常5630min被灭活，但有些毒株5690min被灭活。最适PH为7.0-8.0可被紫外线灭活因其为带囊膜的病毒，故对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。流感病毒的变异n原因：流感病毒结构特点天然宿主的广泛存在密切接触n方式：方式：抗原漂移（抗原漂移（Antigenic driftAntigenic drift）-小变异，同一亚型小变异，同一亚型 -基因点突变所致基因点突变所致 -引起流行引起流行抗原转换（抗原转换（Antigenic shiftAntigenic shift）-大变异大变异 -基因片段交换基因片段交换 -引起大流行引起大流行RNASialic acidAnti
11、bodiesHemagglutininNeuraminidaseHA 和/或 NA 基因的点的变异 频繁发生 A 型和B型发生人类和动物毒株的RNA发生交换(HA 和/或NA基因的全球性变异),导致新的亚型出现 少见但后果严重 只在 A型出现 191819401960198020002020H1N1H2N2H3N2H1N1H1N11918SpanishInfluenzaH1N11957AsianInfluenzaH2N21968HongKongInfluenzaH3N22009NovelInfluenzaH1N1H71980198519952005197519962002H520021997H
12、91999流感的流行情况流感的流行情况抗原漂移所引起的历史上的流感流行 PB1HANAPB1NAN Engl J Med 10.1056/nejmoa0903810甲型H1N1流感病毒 4种不同来源的基因 4 different genes:北美猪流感病毒 North America swine欧亚猪流感病毒 Asia/Europe swine人流感病毒 Human influenza禽流感病毒(非H5)Avian(Non-H5)流感的实验室诊断 流感已成为全球患病人数最多的一类疾病。接种流感疫苗是目前预防和控制流感最经济、最有效的手段，已被广泛采用，并证明有效率达到 70以上。流感疫苗流感疫
13、苗 目前，使用的流感疫苗是三价的，包括两种甲型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗原成分，应用最广泛的有：灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 减毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49岁 当前主要应用的疫苗种类u灭活疫苗种类和生产工艺灭活疫苗种类和生产工艺全病毒疫苗全病毒疫苗裂解疫苗裂解疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗第一代第一代全病毒全病毒价格较低，但副反应较高，部分人群不适宜接种，已逐价格较低，但副反应较高，部分人群不适宜接种，已逐渐淘汰渐淘汰第二代第二代裂解裂解接种效果好，临床副反
14、应较少，适合各年龄段人群接种接种效果好，临床副反应较少，适合各年龄段人群接种第三代第三代亚单位亚单位有效抗原含量高，更安全，价格较高有效抗原含量高，更安全，价格较高灭活疫苗种类灭活疫苗种类3-4月份月份10-11月份月份WHO发布毒株发布毒株生产企业获得生产企业获得和培育毒株和培育毒株疫苗生产疫苗生产销售销售每年世界卫每年世界卫生组织根据生组织根据上一年流感上一年流感病毒流行情病毒流行情况预测下一况预测下一年度流感病年度流感病毒流行株并毒流行株并向各生产企向各生产企业发布业发布从从WHO合作合作实验室获得实验室获得病毒疫苗株，病毒疫苗株，并将病毒在并将病毒在鸡胚内培养，鸡胚内培养，制备毒种制备
15、毒种将病毒接种将病毒接种到鸡胚内培到鸡胚内培养，收获尿养，收获尿囊液，经纯囊液，经纯化、灭活、化、灭活、裂解后制备裂解后制备成疫苗成疫苗2月份月份9月份月份5-9月份月份12-次年次年4月月9月月-次年次年2月份月份5月月-9月月生产周期生产周期5-6个月个月生产工艺生产工艺单价原液制备毒种和病毒尿囊液制备毒种毒种MOIMOI接种量接种量温湿度温湿度培养时间培养时间通风通风温度温度时间时间颜色颜色量量选胚接种培养培养收获纯化裂解裂解产品名称产品名称检定项目检定项目药典标准药典标准主代种子主代种子无菌检查无菌生长血凝滴度不低于1：320支原体检查符合规定鉴别试验采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8
16、病毒滴度不低于6.5Lg EID50/ml外源性禽白血病病毒检测阴性外源性禽腺病毒检测阴性工作种子工作种子无菌检查无菌生长血凝滴度不低于1：320支原体检查符合规定鉴别试验采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5Lg EID50/ml质量控制中间产品质量控制中间品中间品检定项目检定项目长春公司企业注册标准长春公司企业注册标准病毒收获液病毒收获液微生物限度微生物限度10105 5CFU/mlCFU/ml沙门氏菌沙门氏菌阴性阴性血凝滴度血凝滴度1:1601:160细菌内毒素细菌内毒素10EU/ml10EU/ml蛋白含量蛋白含量3.5mg/ml3.5mg/ml病毒浓缩液病毒浓缩液蛋白含
17、量蛋白含量10mg/ml10mg/ml细菌内毒素细菌内毒素160EU/ml160EU/ml病毒纯化液病毒纯化液蛋白含量蛋白含量2.0mg/ml2.0mg/ml病毒裂解病毒裂解纯化液纯化液蛋白含量蛋白含量0.5mg/ml0.5mg/ml病毒灭活病毒灭活纯化液纯化液细菌内毒素细菌内毒素0.2EU/ugHA0.2EU/ugHA灭活验证实验灭活验证实验符合规定符合规定微生物限度微生物限度10CFU/ml10CFU/ml单价病毒原液质量控制单价病毒原液检定项目长春公司企业长春公司企业注册标准注册标准鉴别实验抗原性与推荐的病毒株相一致血凝素含量90ug/ml蛋白含量不高于血凝素含量的4.0倍无菌检查符合规
18、定病毒裂解效果检查病毒颗粒应裂解完全。每次更换流感病毒毒株后生产的前三批单价病毒液须进行该项检查。某些病毒能够与人或动物的红细胞发生凝集，这称之为红细胞凝集反应（HA）。这种凝集反应被加入的特异性血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（HI）。血凝和血凝抑制试验血凝和血凝抑制试验血凝和血凝抑制试验血凝和血凝抑制试验 血凝素含量检测（单扩）血凝素含量检测（单扩）标准直线半成品质量控制半成品检定项目半成品检定项目长春公司企业注册标准长春公司企业注册标准无菌检查符合规定血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量应为配制量的80%120%裂解剂残留量150ug/ml成品检测指标成品检定项目成品检定项目长春
19、公司规程标准长春公司规程标准鉴别实验鉴别实验抗原性与推荐的病毒株相一致抗原性与推荐的病毒株相一致外观外观微乳白色液体，无异味微乳白色液体，无异味装量装量应不低于标示量应不低于标示量pHpH值值6.86.87.87.8血凝素含量血凝素含量每每1ml1ml中各型流感病毒血凝素含中各型流感病毒血凝素含量应为配制量的量应为配制量的80%80%120%120%游离甲醛含量游离甲醛含量50ug/ml50ug/ml卵清蛋白含量卵清蛋白含量100ng/ml100ng/ml总蛋白含量总蛋白含量350ug/ml,350ug/ml,不高于血凝素总含不高于血凝素总含量的量的3.53.5倍倍细菌内毒素细菌内毒素20EU
20、/ml20EU/ml抗生素残留量抗生素残留量50ng/50ng/剂剂无菌检查无菌检查符合规定符合规定异常毒性检查异常毒性检查符合规定符合规定 目前广泛应用流感疫苗 季节性四价流感疫苗 细胞基质流感疫苗 喷鼻减毒活疫苗 基因工程流感疫苗 病毒样颗粒、病毒载体及DNA流感疫苗 通用流感疫苗研发与展望研发与展望疫苗效果影响因素疫苗效果影响因素 接种疫苗是当今预防和控制流感发生和流行最有效的手段。目前，使用的流感疫苗是三价的，包括两种甲型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗原成分，应用最广泛的有：灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 减毒：L
21、ive attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49岁目前广泛应用的流感疫苗目前广泛应用的流感疫苗近年获批上市的新型流感疫苗 充实一下新型流感疫苗表疫苗种类疫苗种类商品名商品名厂家厂家批准地批准地批准时间批准时间剂量剂量对象对象备注备注佐剂疫苗佐剂疫苗FluadNovartis欧洲欧洲199765YMF59/AS03皮内注射皮内注射疫苗疫苗Intanza/IDfluSanofiPasteur欧洲欧洲20099g/株株15g/株株18-59Y60Y高剂量疫高剂量疫苗苗FluzoneSanofiPasteur美国美国200960g/株株65Y细胞培养细胞培养疫苗
22、疫苗InfluvacTCSolvayPharmaceuticalsInc荷兰荷兰2001MDCKOptafluNovartis欧洲欧洲2007亚单位亚单位18YMDCKFlucelvaxNovartis美国美国2012亚单位亚单位18YMDCKCelturaNovartis欧洲欧洲H1N1pdm09亚单位亚单位MF59CelvapanBaxter欧洲欧洲H1N1pdm09全病毒全病毒6MVEROPreflucelBaxter美国美国裂解裂解18-49YVERO重组重组HA疫苗疫苗FluBlokProteinScience201345g/株株18-49Y 1985年后在全球流行的原单一谱系B型流
23、感病毒BYamagata，逐渐演变为二种抗原性截然不同的BVictoria和BYamagata二个谱系交替或者一个谱系为主的混合流行。这二个谱系B型病毒之间很少或者没有交叉保护甲型和乙型流感病毒血凝素甲型和乙型流感病毒血凝素基因进化树基因进化树四价流感疫苗背景四价流感疫苗背景批准时间批准时间批准单位批准单位生产厂家生产厂家疫苗名称疫苗名称疫苗类型疫苗类型 使用方式使用方式 适用人群适用人群20122012年年0202月月美国美国FDA阿斯利康阿斯利康旗下子旗下子公司公司MedImmuneFluMist Quadrivalent vaccine减毒减毒活疫苗活疫苗鼻腔喷雾鼻腔喷雾2-49岁岁20
24、122012年年1212月月美国美国FDA葛兰素史克公司葛兰素史克公司Fluarix裂解疫苗裂解疫苗肌肉注射肌肉注射3岁以上岁以上20132013年年0808月月美国美国FDA葛兰素史克公司葛兰素史克公司FluLaval Quadrivalent裂解疫苗裂解疫苗肌肉注射肌肉注射3岁以上岁以上20132013年年0606月月美国美国FDA赛诺菲赛诺菲巴斯德公司巴斯德公司Fluzone Quadrivalent裂解疫苗裂解疫苗肌肉注射肌肉注射6个月以上个月以上20132013年年1212月月欧盟欧盟阿斯利康阿斯利康公司公司Fluenz Tetra减毒减毒活疫苗活疫苗鼻腔喷雾鼻腔喷雾2-18岁岁已获
25、批的四价流感疫苗在研的四价流感疫苗生产厂家生产厂家疫苗种类疫苗种类/名称名称研发阶段研发阶段SanofiPasteurFluzoneIntradermal18-65岁人群岁人群2014年年9月四月四期临床结束期临床结束FluzoneHigh-Dose65岁以上人群岁以上人群Novartis有佐剂和无佐剂的四价亚单有佐剂和无佐剂的四价亚单位流感疫苗位流感疫苗三期临床中三期临床中CrucellHollandBV（荷兰）（荷兰）四价病毒颗粒流感疫苗四价病毒颗粒流感疫苗（细胞培养）（细胞培养）一期临床中一期临床中ProteinSciencesCorporation四价重组流感病毒疫苗四价重组流感病毒疫
26、苗三期临床中三期临床中bioCSLPTYLTD四价流感疫苗四价流感疫苗四期临床中四期临床中GreenCrossCorporation细胞培养的四价流感疫苗细胞培养的四价流感疫苗一期临床中一期临床中MedImmuneLLC四价减毒流感疫苗四价减毒流感疫苗三期临床结束三期临床结束VaxInnateCorporation四价重组的血凝素季节性流四价重组的血凝素季节性流感疫苗感疫苗一期临床中一期临床中Medicago四价病毒样颗粒流感疫苗四价病毒样颗粒流感疫苗（低剂量、中剂量、高剂量）（低剂量、中剂量、高剂量）二期临床中二期临床中研究中的流感疫苗研究中的流感疫苗1、病毒样颗粒流感疫苗、病毒样颗粒流感疫苗2、病毒载体流感疫苗、病毒载体流感疫苗3、DNA流感疫苗流感疫苗 通用流感疫苗研发趋势研发趋势流感病毒家族中各亚型的流感病毒其流感病毒家族中各亚型的流感病毒其M1M1蛋白、蛋白、M2M2蛋白、蛋白、NPNP蛋白和蛋白和HAHA蛋蛋白的保守表位部分非常稳定。将这些蛋白与佐剂或载体联合制备出通用流白的保守表位部分非常稳定。将这些蛋白与佐剂或载体联合制备出通用流感疫苗，可以刺激机会产生交叉免疫保护反应。感疫苗，可以刺激机会产生交叉免疫保护反应。常用信息网站关爱生命 呵护健康
