1、n什么叫溶血性贫血？什么叫溶血性贫血？hemolytic anemia-指各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的一类贫血。n什么叫溶血性疾病？什么叫溶血性疾病？指骨髓代偿能力尚足以补偿红细胞的损耗而不出现贫血。溶血性贫血的分类溶血性贫血的分类(病因和发病机制病因和发病机制)1、RBC内在缺陷所致的溶贫内在缺陷所致的溶贫 （1）RBC膜缺陷：膜缺陷：遗传球遗传球PNH （2）HB结构异常：结构异常：海洋性贫血海洋性贫血 （3）RBC内酶缺陷：内酶缺陷：G-6PD缺乏症缺乏症2、RBC外来因素所致的溶贫外来因素所致的溶贫 AIHA、药物、化学因素、感染因素、
2、药物、化学因素、感染因素溶血性贫血的分类（溶血的场所）溶血性贫血的分类（溶血的场所）1、血管内溶血：血管内溶血：RBC在循环血液中直接破坏，在循环血液中直接破坏，如如血型不合输血血型不合输血PNH2、血管外溶血：血管外溶血：RBC在脾脏破坏，如在脾脏破坏，如球形球形RBC增多症、脾亢增多症、脾亢3、原位溶血：幼原位溶血：幼RBC在骨髓中溶血，如在骨髓中溶血，如AL、巨、巨幼贫幼贫如何诊断溶血性贫血？如何诊断溶血性贫血？第一步第一步 确定是否有溶血确定是否有溶血第二步第二步 哪一类溶贫哪一类溶贫一、首先确定有无溶血一、首先确定有无溶血（一）找出找出RBC破坏增多的依据破坏增多的依据（1）RBC寿
3、命缩短寿命缩短（2）血片见）血片见RBC碎片碎片（3）血浆游离血浆游离HB增高增高（血管内溶血）（血管内溶血）（4）HB尿检测（），酱油色尿检测（），酱油色（5）尿含铁血黄素试验（）尿含铁血黄素试验（）（6）血清非结合胆红素（间接胆红素）增高）血清非结合胆红素（间接胆红素）增高（7）尿胆原增高）尿胆原增高（8）血清结合珠蛋白减低血清结合珠蛋白减低（9）血浆高铁血红素清蛋白检测（）电泳法血浆高铁血红素清蛋白检测（）电泳法：区带：区带Hb代谢示意图代谢示意图 珠蛋白珠蛋白 血红素血红素 铁铁+卟啉卟啉单核巨噬系统单核巨噬系统 脾脏脾脏血管外溶血血管外溶血RBC血管内溶血血管内溶血血浆游离血浆游离H
4、b肾脏肾脏血红蛋白尿血红蛋白尿游离胆红素游离胆红素肝脏肝脏结合珠蛋白结合珠蛋白近曲小管上皮细胞近曲小管上皮细胞肾阈肾阈结合胆红素结合胆红素粪胆原的肠肝循环粪胆原的肠肝循环含铁血黄素尿含铁血黄素尿 Rous 实验胆汁胆汁粪胆原粪胆原肠道肠道血液血液肾脏肾脏尿胆原尿胆原高铁血红蛋白高铁血红蛋白清蛋白清蛋白/血红素蛋白血红素蛋白溶血性贫血筛查溶血性贫血筛查n红细胞寿命测定红细胞寿命测定n方法：方法：51Cr标记红细胞，检测其半衰期标记红细胞，检测其半衰期n正常红细胞半衰期正常红细胞半衰期2532天天n溶血性贫血者半衰期小于溶血性贫血者半衰期小于15天天n确定溶血性贫血的可靠方法确定溶血性贫血的可靠方
5、法G6PD缺陷症、不稳定Hb、HbH病等常高于45%2条链（erythrocyte osmotic fragility test)PK严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失ADP +PK 磷酸丙酮酸目的：检查红细胞表面的或血清中游离的不完全 抗体，用于诊断AIHA。蛋白质的两性性质是由氨基酸的NH+与COO-决定的。HbF（2 2）0.（erythrocyte osmotic fragility test)正常值：醋纤法（PH8.溶血性贫血的分类（溶血的场所）（2）血片见RBC碎片阳性见于阵发性寒冷性血红蛋白尿患者大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、Cab
6、ot环、点彩红细胞等肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少或消失红细胞孵育渗透脆性试验此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。临床意义常用于轻型遗传球、遗传性非球形细胞溶血的诊断此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。溶血性贫血筛查溶血性贫血筛查n血浆游离血红蛋白测定血浆游离血红蛋白测定n参考值：参考值：50mg/L(1-5mg/dl)n 临床意义：临床意义：n血管内溶血者明显升高血管内溶血者明显升高nAIHA、珠蛋白生成障碍性贫血者轻度升高、珠蛋白生成障碍性贫血者轻度升高n血管外溶血时正常血管外溶血时正常溶血性贫血筛查溶血性贫血筛查n血清结合珠蛋白测定血清结合珠蛋白测定n参考值：
7、参考值：0.7-1.5g/Ln临床意义：临床意义：n各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著n肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少或消失肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少或消失n感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝外阻塞性黄疸可增高外阻塞性黄疸可增高溶血性贫血筛查溶血性贫血筛查n血浆高铁血红素清蛋白测定血浆高铁血红素清蛋白测定n方法：方法：n生化法：与硫化铵形成铵血色原，经光谱仪测定生化法：与硫化铵形成铵血色原，经光谱仪测定558nm吸收光带吸收光带n电泳法：醋酸纤维膜电泳电泳法：醋酸纤维膜电泳n正常
8、值：阴性正常值：阴性n临床意义：阳性者表示严重的血管内溶血临床意义：阳性者表示严重的血管内溶血6）HbA 96%98%，HbA2 1.见于蚕豆病、伯氨喹型药物溶血性贫血2、红细胞孵育渗透脆性试验（二）红细胞酶缺陷的检验脆性增高 遗传性球形红细胞增多症1、酸溶血试验(Ham试验)2、红细胞孵育渗透脆性试验（erythrocyte osmotic fragility test)临床意义常用于轻型遗传球、遗传性非球形细胞溶血的诊断2、RBC外来因素所致的溶贫PK严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。氧合HB（Fe2+）红色34%NaCl溶液红细胞完全破裂
9、目的：测定血清中游离的不完全抗体（erythrocyte osmotic fragility test)电泳：一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。G6PD缺陷导致高铁血红蛋白还原率下降原理：在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；阵发性寒冷性血红蛋白尿症（PCH）患者的血清中有双相溶血素，在0-4C时，溶血素与红细胞结合，并吸附补体，但不溶血；丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定原理:G6PD 使NADP还原成NADPH,后者在紫外线照射下发出荧光溶血性贫血筛查溶血性贫血筛查n含铁血黄素尿试验（含铁血黄素尿试验（Rous试验）试验）n原理：原理：
10、n铁离子铁离子+氰化钾氰化钾 铁氰化铁（蓝色）铁氰化铁（蓝色）n如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性n正常值：阴性正常值：阴性n临床意义：阳性者表示慢性血管内溶血，如临床意义：阳性者表示慢性血管内溶血，如PNH含铁血黄素含铁血黄素（二）显示红细胞代偿增生依据二）显示红细胞代偿增生依据n外周血网织红增多；外周血网织红增多；n外周血红细胞形态：外周血红细胞形态：大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、小体、Cabot环、点彩红细胞等环、点彩红细胞等n增生性贫血骨髓象：增生性贫血骨髓象：
11、增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨核系一般正常核系一般正常 二、哪一类溶血性贫血？二、哪一类溶血性贫血？（一）红细胞膜缺陷的检验（一）红细胞膜缺陷的检验 红细胞渗透脆性试验 红细胞孵育渗透脆性试验自身溶血试验及纠正试验1、红细胞渗透脆性试验红细胞渗透脆性试验原理原理:n正常红细胞为双凹圆盘状正常红细胞为双凹圆盘状,在低渗盐水中吸水膨胀的在低渗盐水中吸水膨胀的适应性较大适应性较大(可增加可增加70%的体积而不破裂的体积而不破裂)n遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积/体积体积(S/V)的比值小的比值小,对低
12、渗盐水的适应性小对低渗盐水的适应性小(脆性增大脆性增大)n本试验是测定红细胞在一系列不同浓度低渗氯化钠本试验是测定红细胞在一系列不同浓度低渗氯化钠盐水内开始溶血和完全溶血的氯化钠浓度，检测其盐水内开始溶血和完全溶血的氯化钠浓度，检测其对不同浓度的低渗盐水溶血的抵抗力。对不同浓度的低渗盐水溶血的抵抗力。红细胞渗透脆性试验红细胞渗透脆性试验（erythrocyteosmoticfragilitytest)原理：原理：低渗溶液低渗溶液红细胞皱缩红细胞皱缩红细胞膨胀红细胞膨胀甚至破裂甚至破裂高渗溶液高渗溶液等渗溶液等渗溶液正常正常低渗溶液低渗溶液 参考值参考值 0.6-0.8%NaCl0.6-0.8%
13、NaCl溶液溶液红细胞不破裂红细胞不破裂 0.42-0.46%NaCl0.42-0.46%NaCl溶液溶液部分红细胞破裂部分红细胞破裂 0.28-0.34%NaCl0.28-0.34%NaCl溶液溶液红细胞完全破裂红细胞完全破裂NaCl0.85%0.6%0.42%0.34%0.8%0.7%对低渗溶液抵抗能力对低渗溶液抵抗能力减小减小即即RBCRBC渗透脆性渗透脆性增加增加n临床意义临床意义 （1）脆性增高）脆性增高 n开始溶血及完全溶血时氯化钠浓度较正常对照提前两管，即0.04%以上;开始溶血0.5%，完全溶血0.38%n主要见于遗传性球形红细胞增多症（2）脆性减低）脆性减低 n小细胞低色素性
14、贫血：海洋性贫血、缺铁性贫血 2、红细胞孵育渗透脆性试验、红细胞孵育渗透脆性试验 原理原理 37孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀，脆性增高。参考值参考值 未孵育未孵育 50%溶血溶血44.45g/LNaCl 孵育孵育 50%溶血溶血4.655.9g/LNaCL 临床意义临床意义常用于轻型遗传球、遗传性非球形常用于轻型遗传球、遗传性非球形细胞溶血的诊断细胞溶血的诊断 n 脆性增高 遗传性球形红细胞增多症n 脆性减低 缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、镰形细胞贫血、脾切除术后3、自身溶血试验及纠正试验、自身溶血试验及纠正试验 原理原理 n先天性非球形红细胞溶
15、血患者红细胞内酶缺陷，葡萄糖先天性非球形红细胞溶血患者红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，酵解障碍，ATP不足不能维持细胞钠泵作用不足不能维持细胞钠泵作用n患者红细胞在自身血浆中孵育患者红细胞在自身血浆中孵育48h，溶血增强，可加入，溶血增强，可加入葡萄糖、葡萄糖、ATP，观察溶血能否被纠正，观察溶血能否被纠正 参考值参考值 n正常人正常人孵育后轻微溶血、溶血度孵育后轻微溶血、溶血度3.5%n加葡萄糖和加加葡萄糖和加ATP后，溶血明显纠正，溶血度后，溶血明显纠正，溶血度1%3、自身溶血试验及纠正试验、自身溶血试验及纠正试验 临床意义临床意义常用于遗传球、遗传性非球形细胞常用于遗传球、遗传性非球形细
16、胞溶血的鉴别诊断溶血的鉴别诊断 遗传性球形细遗传性球形细胞增多症胞增多症遗传性非球形细胞性溶贫遗传性非球形细胞性溶贫（型）葡萄糖型）葡萄糖6 6磷酸脱氢酶缺陷症磷酸脱氢酶缺陷症（型）丙酮酸型）丙酮酸激酶缺陷症激酶缺陷症孵育后溶血孵育后溶血增强增强增强增强增强增强加葡萄糖后溶血加葡萄糖后溶血明显纠正明显纠正部分纠正部分纠正不能纠正不能纠正加加ATPATP后溶血后溶血明显纠正明显纠正部分纠正部分纠正纠正纠正丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定结果:正常人标本呈红色HbF（2 2）0.血红素开始溶血及完全溶血时氯化钠浓度较正常对照提前两管，即0.丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定（一）找出RBC破坏增多的
17、依据按抗体反应最适温度分为温抗体型和冷抗体型，后者又分为冷凝集素综合征和阵发性冷性血红蛋白尿AIHA分三型：C3型12%，IgG型24%，IgG+C3型60%。04%以上;开始溶血0.（一）找出RBC破坏增多的依据此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性3、自身溶血试验及纠正试验当升温至30-37C则发生溶血临床意义：阳性者表示严重的血管内溶血氧合HB（Fe2+）红色如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性珠蛋白：由4条多肽链组成原理：在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；直接Coombs Test(+)说明病人R
18、BC表面上包被有不完全抗体1、高铁血红蛋白还原试验（二）红细胞酶缺陷的检验（二）红细胞酶缺陷的检验 n定义：红细胞酶缺陷所致溶血性贫血又称红细胞酶病，指参与红细胞代谢的酶由于基因缺陷，导致活性改变而发生溶血的一组疾病n内容：n高铁血红蛋白还原试验n氰化物-抗坏血酸试验n变性珠蛋白小体生成试验n葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定n丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定n原理原理1、高铁血红蛋白还原试验、高铁血红蛋白还原试验G6PD正常正常nNADPH还原型辅酶还原型辅酶n烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸高铁血红蛋白高铁血红蛋白亚铁血红蛋白亚铁血红蛋白NADPH充足充足G6PD
19、高铁高铁Hb还原酶还原酶G6PG6-PANADPNADPH还原型美兰还原型美兰氧化型美兰氧化型美兰高铁高铁Hb（Fe3+）为褐色）为褐色氧合氧合HB（Fe2+）红色）红色结果：结果：光电比色法光电比色法，正常还原率，正常还原率75%，低于，低于75%为异常，为异常，提示提示G6PD活力活力，74 31%为为G-6PD缺乏的杂合子（红棕缺乏的杂合子（红棕色），色），30%以下为显著缺陷的纯合子（为棕色以下为显著缺陷的纯合子（为棕色 目测比色法）。目测比色法）。n参考值参考值n高铁血红蛋白还原率高铁血红蛋白还原率75%n高铁血红蛋白高铁血红蛋白0.31.3g/Ln临床意义临床意义nG6PD缺陷导致
20、高铁血红蛋白还原率下降缺陷导致高铁血红蛋白还原率下降n见于蚕豆病、伯氨喹型药物溶血性贫血见于蚕豆病、伯氨喹型药物溶血性贫血1、高铁血红蛋白还原试验原理原理:6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 NADP GSH H202 氧合血红蛋白氧合血红蛋白 6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白高铁血红蛋白结果结果:正常人标本呈红色正常人标本呈红色G-6PD2、氰化物-抗坏血酸试验临床意义临床意义:n正常血液数小时后变成暗色正常血液数小时后变成暗色n纯合子纯合子G6PD缺乏者缺乏者2h变色变色n杂合子杂合子G6PD缺乏者缺乏者34h变色变色3、变性珠蛋白小体生成试验、变性珠蛋白小体
21、生成试验n又称又称“红细胞包涵体红细胞包涵体”、“赫恩小体赫恩小体”、“Heinz小体小体”、“海因小体海因小体”n原理原理：G-6PD缺乏致红细胞内缺乏致红细胞内GSH减少，高铁减少，高铁血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体，沉着于血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体，沉着于红细胞膜上。红细胞膜上。抗凝血+乙酰苯肼37温育24h充分的氧化其Hb氧化成Heinz小体（用结晶紫、甲紫或煌焦油兰染色，油镜观察）n1.正常人正常人 30%n2.G6PD缺陷症缺陷症、不稳定、不稳定H b、H b H 病 等 常 高 于病 等 常 高 于45%结果：结果：该小体为圆形或多角形该小体为圆形或多角形色涵体，色涵体，
22、0.22um。多位于红细多位于红细胞边缘，一个红细胞含胞边缘，一个红细胞含120个，个，多为多为12个，以含个，以含5个以上小体的个以上小体的红细胞计数红细胞计数4、G6PD荧光斑点试验和活性测定荧光斑点试验和活性测定原理原理:G6PD 使使NADP还原成还原成NADPH,后者在紫外线后者在紫外线照射下发出荧光照射下发出荧光 参考值：参考值：正常人强荧光；正常人强荧光；酶活性酶活性 5 U/gHb 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 NADP GSH H202 氧合血红蛋氧合血红蛋白白 6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白高铁血红蛋白G-6PD5、丙酮酸激酶荧光筛选试
23、验和活性测定、丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定原理原理:ADP +PK 磷酸丙酮酸磷酸丙酮酸 丙酮酸丙酮酸 NAPH 乳酸乳酸 NAD（无荧光）（无荧光）n参考值参考值n正常正常PK活性荧光在活性荧光在20min内消失内消失n酶活性酶活性15.14.99U/gHbn临床意义临床意义nPK严重缺乏（纯合子）荧光严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失不消失n杂合子荧光杂合子荧光2560min消失消失(三三)、珠蛋白合成异常的检测、珠蛋白合成异常的检测n血红蛋白的结构血红蛋白的结构 原卟啉原卟啉 血红素血红素HbHb（四聚体）（四聚体）铁铁 2 2条条链链 珠蛋白：由珠蛋白：由4 4条多肽链组成条多
24、肽链组成 2 2条非条非链链正常人正常人HbA（2 2）97%HbA2（2 2）1.5-3%HbF（2 2）0.5-0.8%34%NaCl溶液红细胞完全破裂丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定6）HbA 96%98%，HbA2 1.此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。正常人孵育后轻微溶血、溶血度3.大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、Cabot环、点彩红细胞等Coombs血清（抗人球蛋白血清）蔗糖溶液加强补体与红细胞结合，使蔗糖进入红细胞，导致溶血增强NADPH还原型辅酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定2、RBC外来因素所致的溶贫如肾小管
25、上皮有含铁血黄素，该试验阳性目的：测定血清中游离的不完全抗体遗传性非球形细胞性溶贫结果:正常人标本呈红色含铁血黄素尿试验（Rous试验）AIHA分三型：C3型12%，IgG型24%，IgG+C3型60%。溶血性贫血的分类（溶血的场所）遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积/体积(S/V)的比值小,对低渗盐水的适应性小(脆性增大)氧合HB（Fe2+）红色 血红蛋白病血红蛋白病珠蛋白肽链量的不正常珠蛋白肽链量的不正常(地中海贫血地中海贫血)血红蛋白分子结构异常血红蛋白分子结构异常(异常血红蛋白病异常血红蛋白病)遗传性溶血性疾病遗传性溶血性疾病 1.血红蛋白电泳血红蛋白电泳蛋白质的两性性质蛋白质的两性
26、性质是由氨基酸的是由氨基酸的NH+与与COO-决定的。决定的。等电点等电点调节水溶液的调节水溶液的pH，能使蛋白质的，能使蛋白质的NH+与与COO-数目相等呈电中性，数目相等呈电中性，此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。电泳：电泳：一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。原理：原理：在一定的在一定的pH缓冲液中，缓冲液的缓冲液中，缓冲液的pH大于大于Hb等电点，其带负电，在等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；反之向阴极移动。电场中向阳极移动；反之向阴极移动。由于各种由于各种Hb珠蛋
27、白肽链结构不同，其珠蛋白肽链结构不同，其等电点不同，电泳方向和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电等电点不同，电泳方向和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电泳扫描，可进行泳扫描，可进行Hb定量分析。定量分析。(+)HJKAGDE(-)1.HbH增多是增多是HbH病，为病，为-地中海贫血的一种；地中海贫血的一种；HbA2明显增明显增高见于轻型高见于轻型地中海贫血；地中海贫血；HbF 明显增高见于中重型明显增高见于中重型地中海地中海贫血。贫血。2.正常值：醋纤法（正常值：醋纤法（PH8.6）HbA96%98%，HbA21.0%3.1%，HbF2%电电 泳泳 结结 果果CAA2F
28、A异常异常正常正常 2.胎儿蛋白胎儿蛋白HbF（2 2）酸洗脱试）酸洗脱试验：验：含含HbF红细胞着色红细胞着色原理：原理：nHbF抗酸力强抗酸力强临床意义：临床意义：n脐带血、新生儿、婴儿阳性脐带血、新生儿、婴儿阳性n成人小于成人小于1%n地中海贫血轻者少数红细胞阳性地中海贫血轻者少数红细胞阳性n地中海贫血重症阳性细胞增多地中海贫血重症阳性细胞增多 3.HbF定量测定（碱变性试验）定量测定（碱变性试验）:原理：原理：n碱性溶液中碱性溶液中HbF不易变性沉淀，可测定滤液不易变性沉淀，可测定滤液中中Hb量量临床意义：临床意义：n2岁岁-成人成人 HbF4%为异常为异常n重型重型 地贫地贫80-9
29、0%n AL、AA、淋巴瘤等可轻度升高、淋巴瘤等可轻度升高 4.HbA2定量测定定量测定 诊断轻型诊断轻型 地贫的重要依据地贫的重要依据5.限制性内切酶谱分析限制性内切酶谱分析 基因诊断基因诊断(四四)、自身免疫性溶血性贫血检测、自身免疫性溶血性贫血检测此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性（PNH），此试验可作为PNH的确诊试验。含铁血黄素尿试验（Rous试验）各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著高铁血红蛋白还原率75%(四)、自身免疫性溶血性贫血检测(+)H J K A G D E (-)感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝外阻塞性黄疸可增高PK
30、严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失主要见于遗传性球形红细胞增多症3、自身溶血试验及纠正试验Hb（四聚体）铁原理：在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；溶血性贫血的分类（溶血的场所）多位于红细胞边缘，一个红细胞含120个，多为12个，以含5个以上小体的红细胞计数1、酸溶血试验(Ham试验)主要见于遗传性球形红细胞增多症自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia,AIHA)PK严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失蔗糖溶液加强补体与红细胞结合，使蔗糖进入红细胞，导致溶血增强碱性溶液中HbF不易变性沉淀，可测定滤液中Hb
31、量（五）、阵发性睡眠性血红蛋白尿paroxysmal noturnal hemoglobinuria,PNH为获得性红细胞膜缺陷引起的慢性血管内溶血常在睡眠时加重也可伴有发作性睡眠性血红蛋白尿和全血细胞减少自身免疫性溶血性贫血自身免疫性溶血性贫血 （autoimmune hemolytic anemia,AIHA)定义：定义：体内免疫异常，产生自身抗体、补体，结合在红细体内免疫异常，产生自身抗体、补体，结合在红细胞膜上使红细胞破坏加速胞膜上使红细胞破坏加速病因：病因：尚未完全阐明，可能因素：病毒感染可激活多克隆尚未完全阐明，可能因素：病毒感染可激活多克隆B B细胞或化学物与红细胞膜相结合，改变
32、其抗原性，导细胞或化学物与红细胞膜相结合，改变其抗原性，导致自身抗体产生致自身抗体产生分类：分类：可为原发性的，也可继发于结缔组织病、造血系统肿瘤、可为原发性的，也可继发于结缔组织病、造血系统肿瘤、感染等感染等 按抗体反应最适温度分为温抗体型和冷抗体型，后者又按抗体反应最适温度分为温抗体型和冷抗体型，后者又分为冷凝集素综合征和阵发性冷性血红蛋白尿分为冷凝集素综合征和阵发性冷性血红蛋白尿1.Coombs试验（抗人球蛋白试验）试验（抗人球蛋白试验）原理：原理：不完全抗体不完全抗体(IgG)，无法架接两个邻近的红细胞，而只，无法架接两个邻近的红细胞，而只能和一个红细胞抗原相结合。能和一个红细胞抗原相
33、结合。抗人球蛋白抗体是完全抗体抗人球蛋白抗体是完全抗体,可与多个不完全抗体的可与多个不完全抗体的Fc段相结合段相结合,导致红细胞凝集现象导致红细胞凝集现象,称为抗人球蛋白试验阳性。称为抗人球蛋白试验阳性。目的：目的：检查红细胞表面的或血清中游离的不完全检查红细胞表面的或血清中游离的不完全 抗体，用于诊断抗体，用于诊断AIHA。n直接直接Coombs Test(+)说明病人说明病人RBC表面上包被有不完全抗体表面上包被有不完全抗体n间接间接Coombs Test(+)则说明病人血清中存在着不完全抗体则说明病人血清中存在着不完全抗体Coombs血血清清（抗（抗人球蛋白人球蛋白血血清清）（1）直接试
34、验）直接试验正常人：阴性正常人：阴性直接反应阳性，最常见于直接反应阳性，最常见于AIHA（其他有药物诱（其他有药物诱发的溶贫、阵发性冷性发的溶贫、阵发性冷性Hb尿、新生儿同种免疫溶尿、新生儿同种免疫溶血病、血病、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤等）。、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤等）。目的：目的：测定吸附于红细胞表面的不完全抗体测定吸附于红细胞表面的不完全抗体方法：方法：结果：结果：（2）间接试验）间接试验有过剩抗体时直接、间接均为阳性。有过剩抗体时直接、间接均为阳性。AIHA分三型：分三型：C3型型12%，IgG型型24%，IgG+C3型型60%。冷凝集素病为。冷凝集素病为IgM抗体。抗体。目的
35、：目的：测定血清中游离的不完全抗体测定血清中游离的不完全抗体方法方法：结果：结果：间接阳性，见于间接阳性，见于AIHA，正常人为阴性，正常人为阴性。病人血清正常RBC抗 IgG2.冷凝集素试验冷凝集素试验n原理n冷凝激素是可逆性抗体：低温时可与自身红细胞、O型红细胞、患者同型红细胞发生凝集，温度升高时，凝集块又复消失n参考值n效价低于1:40，反应最高温度4n临床意义n某些AIHA很高3.冷热双相溶血试验冷热双相溶血试验原理：原理：n阵发性寒冷性血红蛋白尿症（阵发性寒冷性血红蛋白尿症（PCH）患者的血）患者的血清中有双相溶血素，在清中有双相溶血素，在0-4 C时，溶血素与红时，溶血素与红细胞结
36、合，并吸附补体，但不溶血；当升温至细胞结合，并吸附补体，但不溶血；当升温至30-37 C则发生溶血则发生溶血参考值：参考值：阴性阴性临床意义：临床意义：阳性见于阵发性寒冷性血红蛋白尿患者阳性见于阵发性寒冷性血红蛋白尿患者（五）、阵发性睡眠性血红蛋白尿（五）、阵发性睡眠性血红蛋白尿paroxysmal noturnal hemoglobinuria,PNH为获得性红细胞膜缺陷引起的慢性血管内溶血为获得性红细胞膜缺陷引起的慢性血管内溶血常在睡眠时加重常在睡眠时加重也可伴有发作性睡眠性血红蛋白尿和全血细胞减少也可伴有发作性睡眠性血红蛋白尿和全血细胞减少1、酸溶血试验、酸溶血试验(Ham试验试验)原理
37、：原理：PNH患者红细胞膜对补体敏感患者红细胞膜对补体敏感,在酸性在酸性(pH6.46.5)条件下条件下,能被正常人新鲜血清能被正常人新鲜血清(含含补体补体)所溶解所溶解,产生酸溶血现象。产生酸溶血现象。临床意义：临床意义：正常人阴性正常人阴性阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性（PNH），此试验），此试验可作为可作为PNH的的确诊试验。确诊试验。2.蔗糖溶血试验蔗糖溶血试验（sucrose hemolysis test)原理：原理：n蔗糖溶液加强补体与红细胞结合，使蔗糖进入红细胞，蔗糖溶液加强补体与红细胞结合，使蔗糖进入红细胞，导致溶血增强导致溶血增强临床意义：临床意义：n敏
38、感性最高，特异性差敏感性最高，特异性差n是是PNH的筛选试验的筛选试验n阴性常可排除阴性常可排除PNH，阳性需再做，阳性需再做Ham 试验。阳性率试验。阳性率90-91%。3.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子溶血试验原理：原理：n蛇毒因子直接激活补体蛇毒因子直接激活补体C3，旁路途径激活补，旁路途径激活补体系统，攻击体系统，攻击PNH病人红细胞病人红细胞临床意义：临床意义：n是特异性是特异性PNH试验，敏感性优于试验，敏感性优于Ham试验试验 常用的溶血性贫血病因实验检查项目常用的溶血性贫血病因实验检查项目项目项目结果结果常见疾病常见疾病红细胞脆性试验红细胞脆性试验增高增高遗传性球形红细胞增多症遗传性
39、球形红细胞增多症抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验阳性阳性AIHA；药物免疫性溶血性贫血；新生；药物免疫性溶血性贫血；新生儿同种免疫容血病；冷凝集素综合症儿同种免疫容血病；冷凝集素综合症酸溶血试验酸溶血试验阳性阳性PNH（确诊试验）（确诊试验）蔗糖溶血试验蔗糖溶血试验阳性阳性PNH（筛选试验）（筛选试验）高铁血红蛋白还原试验高铁血红蛋白还原试验还原率减低还原率减低G6PD缺乏症缺乏症血红蛋白电泳血红蛋白电泳异常异常用于检查用于检查HbC、HbBartS等等乳酸 NAD（无荧光）蔗糖溶液加强补体与红细胞结合，使蔗糖进入红细胞，导致溶血增强含铁血黄素尿试验（Rous试验）hemolytic anemia
40、-指各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的一类贫血。参考值：50mg/L(1-5mg/dl)6-磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白目的：检查红细胞表面的或血清中游离的不完全 抗体，用于诊断AIHA。阳性见于阵发性寒冷性血红蛋白尿患者此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定丙酮酸 NAPH（5）尿含铁血黄素试验（）增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨核系一般正常提示G6PD活力，74 31%为G-6PD缺乏的杂合子（红棕（2）HB结构
41、异常：海洋性贫血如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨核系一般正常变性珠蛋白小体生成试验参考值：50mg/L(1-5mg/dl)结果:正常人标本呈红色目的：测定吸附于红细胞表面的不完全抗体项目项目结果结果常见疾病常见疾病HbA2增高增高 地贫地贫HbF增高增高 地贫地贫冷热溶血试验冷热溶血试验阳性阳性PCH 病病溶血性贫血筛查溶血性贫血筛查n血清结合珠蛋白测定血清结合珠蛋白测定n参考值：参考值：0.7-1.5g/Ln临床意义：临床意义：n各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著n肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少
42、或消失肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少或消失n感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝外阻塞性黄疸可增高外阻塞性黄疸可增高1、红细胞渗透脆性试验红细胞渗透脆性试验原理原理:n正常红细胞为双凹圆盘状正常红细胞为双凹圆盘状,在低渗盐水中吸水膨胀的在低渗盐水中吸水膨胀的适应性较大适应性较大(可增加可增加70%的体积而不破裂的体积而不破裂)n遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积/体积体积(S/V)的比值小的比值小,对低渗盐水的适应性小对低渗盐水的适应性小(脆性增大脆性增大)n本试验是测定红细胞在一系列不同浓度低渗
43、氯化钠本试验是测定红细胞在一系列不同浓度低渗氯化钠盐水内开始溶血和完全溶血的氯化钠浓度，检测其盐水内开始溶血和完全溶血的氯化钠浓度，检测其对不同浓度的低渗盐水溶血的抵抗力。对不同浓度的低渗盐水溶血的抵抗力。2、红细胞孵育渗透脆性试验、红细胞孵育渗透脆性试验 原理原理 37孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀，脆性增高。参考值参考值 未孵育未孵育 50%溶血溶血44.45g/LNaCl 孵育孵育 50%溶血溶血4.655.9g/LNaCL 临床意义临床意义常用于轻型遗传球、遗传性非球形常用于轻型遗传球、遗传性非球形细胞溶血的诊断细胞溶血的诊断 n 脆性增高 遗
44、传性球形红细胞增多症n 脆性减低 缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、镰形细胞贫血、脾切除术后（二）红细胞酶缺陷的检验（二）红细胞酶缺陷的检验 n定义：红细胞酶缺陷所致溶血性贫血又称红细胞酶病，指参与红细胞代谢的酶由于基因缺陷，导致活性改变而发生溶血的一组疾病n内容：n高铁血红蛋白还原试验n氰化物-抗坏血酸试验n变性珠蛋白小体生成试验n葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定n丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定 1.血红蛋白电泳血红蛋白电泳蛋白质的两性性质蛋白质的两性性质是由氨基酸的是由氨基酸的NH+与与COO-决定的。决定的。等电点等电点调节水溶液的调节水溶液的pH，能使蛋白质的，能使蛋白质
45、的NH+与与COO-数目相等呈电中性，数目相等呈电中性，此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。电泳：电泳：一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。原理：原理：在一定的在一定的pH缓冲液中，缓冲液的缓冲液中，缓冲液的pH大于大于Hb等电点，其带负电，在等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；反之向阴极移动。电场中向阳极移动；反之向阴极移动。由于各种由于各种Hb珠蛋白肽链结构不同，其珠蛋白肽链结构不同，其等电点不同，电泳方向和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电等电点不同，电泳方向
46、和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电泳扫描，可进行泳扫描，可进行Hb定量分析。定量分析。1.Coombs试验（抗人球蛋白试验）试验（抗人球蛋白试验）原理：原理：不完全抗体不完全抗体(IgG)，无法架接两个邻近的红细胞，而只，无法架接两个邻近的红细胞，而只能和一个红细胞抗原相结合。能和一个红细胞抗原相结合。抗人球蛋白抗体是完全抗体抗人球蛋白抗体是完全抗体,可与多个不完全抗体的可与多个不完全抗体的Fc段相结合段相结合,导致红细胞凝集现象导致红细胞凝集现象,称为抗人球蛋白试验阳性。称为抗人球蛋白试验阳性。目的：目的：检查红细胞表面的或血清中游离的不完全检查红细胞表面的或血清中游离的不完全
47、 抗体，用于诊断抗体，用于诊断AIHA。n直接直接Coombs Test(+)说明病人说明病人RBC表面上包被有不完全抗体表面上包被有不完全抗体n间接间接Coombs Test(+)则说明病人血清中存在着不完全抗体则说明病人血清中存在着不完全抗体此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。46%NaCl溶液部分红细胞破裂如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性（型）葡萄糖6磷酸脱氢酶缺陷症（型）葡萄糖6磷酸脱氢酶缺陷症地中海贫血轻者少数红细胞阳性2、红细胞孵育渗透脆性试验1、酸溶血试验(Ham试验)5、丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。主要见于遗传性球
48、形红细胞增多症2、红细胞孵育渗透脆性试验PK严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失NADPH还原型辅酶肝病、传单、先天性无结合珠蛋白血症减少或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定（型）葡萄糖6磷酸脱氢酶缺陷症34%NaCl溶液红细胞完全破裂6-磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白原理:G6PD 使NADP还原成NADPH,后者在紫外线照射下发出荧光PK严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失（2）HB结构异常：海洋性贫血（1）直接试验）直接试验正常人：阴性正常人：阴性直接反应阳性，最常见于直接反应阳性，最常见于AIHA（其他有药物诱（其他有药物诱发的溶贫、阵发性冷
49、性发的溶贫、阵发性冷性Hb尿、新生儿同种免疫溶尿、新生儿同种免疫溶血病、血病、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤等）。、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤等）。目的：目的：测定吸附于红细胞表面的不完全抗体测定吸附于红细胞表面的不完全抗体方法：方法：结果：结果：溶血性贫血的分类（溶血的场所）地中海贫血轻者少数红细胞阳性（3）血浆游离HB增高（血管内溶血）抗人球蛋白抗体是完全抗体,可与多个不完全抗体的Fc段相结合,导致红细胞凝集现象,称为抗人球蛋白试验阳性。遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积/体积(S/V)的比值小,对低渗盐水的适应性小(脆性增大)（1）RBC膜缺陷：遗传球PNH蔗糖溶液加强补体与红细胞结合
50、，使蔗糖进入红细胞，导致溶血增强ADP +PK 磷酸丙酮酸1、血管内溶血：RBC在循环血液中直接破坏，如血型不合输血PNH2、红细胞孵育渗透脆性试验正常值：醋纤法（PH8.酶活性 5 U/gHb1、高铁血红蛋白还原试验方法：51Cr标记红细胞，检测其半衰期此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝外阻塞性黄疸可增高大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、Cabot环、点彩红细胞等Hb（四聚体）铁各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著地中海贫血重症阳性细胞增多第一步 确定是否有溶血临床意义常用于轻型遗传球、遗传性非
