1、电子科大细胞生物学第三章细胞生物学研究方法 概要了解细胞生物学常用研究方法，概要了解细胞生物学常用研究方法，包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微操作技术等。操作技术等。u 细胞形态结构观察方法细胞形态结构观察方法u 细胞组分分析方法细胞组分分析方法u 细胞培养、细胞工程与显微操细胞培养、细胞工程与显微操作技术作技术第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术（light microscopy)肉眼的分辨率：肉眼的分辨率：0.2mm；光镜分
2、辨率：光镜分辨率：0.2um；EM分辨率可达到分辨率可达到0.2nm1m=103mm=106um=109nm原理与应用原理与应用 直接荧光标记技术直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术间接免疫荧光标记技术 应用：在光镜水平用于特异蛋白质等生应用：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位。物大分子的定性定位。（Fluorescence Microscopy）一、光学显微镜技术（light microscopy)动物原代细胞培养步骤概要了解细胞生物学常用研究方法，包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微操作技术等。细胞长梭形,核圆位中央,胞质常外伸2-3个长短
3、突起,多数细胞排列疏散,有较大细胞间隙,有时也相互平行排列，成群细胞呈放射状、旋涡状等形式。（3）透射电镜主要制样技术用纤维素酶去掉细胞壁得到原生质体，后者在无菌条件下生长分裂，经诱导分化最终长成植株。之后，用小鼠骨髓瘤细胞与免疫过小鼠的脾细胞在PEG或灭活病毒介导下发生融合。福尔根染色（Feulgen Stain）可见光显微分光光度测定法利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特性，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）染色背景，衬托出样品的精细结构。2）可实时得到样品表面三维图象
4、，可测量厚度信息。细胞系细胞与体内原来的细胞比，其形态、结构、遗传上存在不同程度的变异。环氧树脂：国产618环氧树脂、Epon812等如如:将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射入培养细胞中，可以看到肌动蛋白射入培养细胞中，可以看到肌动蛋白分子组装成肌动蛋白纤维。分子组装成肌动蛋白纤维。将可产生荧光的绿色荧光蛋白（将可产生荧光的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因与某基因与某种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋白的细胞中，便可直接观察到该蛋白白的细胞中，便可直接观察到该蛋白的动态变化。的动态变化。
5、物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点，彼此互相共物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点，彼此互相共聚焦。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物聚焦。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光（样镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光（样品一般经免疫荧光标品一般经免疫荧光标记）经透镜汇聚成像，记）经透镜汇聚成像，被检测器检出。通过被检测器检出。通过样品其他部位的激光样品其他部位的激光即激光发出的荧光不即激光发出的荧光不会聚焦成像，因而检会聚焦成像，因而检测器不能检出。测器不能检出。排除焦平面以外光的干扰，增强图像反排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率差和提高分辨率(1
6、.41.7倍倍)，可重构，可重构样品的三维结构。样品的三维结构。（fluorescence resonance enerrgy transfer,FRET）用于检测活细胞中两个蛋白质分子之间用于检测活细胞中两个蛋白质分子之间的直接相互作用。的直接相互作用。供体发射的荧光与受体发色团分子的吸供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，且两个探针距离在收光谱重叠，且两个探针距离在10nm范围以范围以内时，会发生一种非放射性的能量转移，产内时，会发生一种非放射性的能量转移，产生生FRET现象。现象。可选择供体蛋白可选择供体蛋白CFP和受体蛋白和受体蛋白YFP分分别与两种目的蛋白融合表达。当这两个融
7、合别与两种目的蛋白融合表达。当这两个融合蛋白之间的距离在蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，供体的范围内，供体CFP发出的荧光可被发出的荧光可被YFP所吸收，并激发所吸收，并激发YFP发出黄色荧光。此时可通过测量发出黄色荧光。此时可通过测量CFP荧荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧所发出的荧光被光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到接收的量就越多，检测器所接收到的荧光越少。反之，不会产生的荧光越少。反之，不会产生FRET效应。效应。（fluorescence recovery aft
8、er photobleaching,FRAP）该技术起源于该技术起源于20世纪世纪70年代。使用与蛋年代。使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等，检测活体子，如荧光素、绿色荧光蛋白等，检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。结构上分子动态变化率的大小。步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）；原代细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能渡过“危机”而传下去。染色背景，衬托出样品的精细结构。
9、供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，且两个探针距离在10nm范围以内时，会发生一种非放射性的能量转移，产生FRET现象。电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）取材 固定 脱水 浸透 包埋 切片 染色 观察应用：实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。用花药在人工培养基上进行培养。三、特异蛋白抗原的定位与定性之后，用小鼠骨髓瘤细胞与免疫过小鼠的脾细胞在PEG或灭活病毒介导下发生融合。放射自显影技术细胞外形不规则且多变，细胞密度增大连接成片时，形状类似成纤维细胞型或上皮细胞型。细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）1、透
10、射电镜（TEM）应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；高能量激光束照射使特定区域，该高能量激光束照射使特定区域，该区域荧光会发生不可逆淬灭。光漂区域荧光会发生不可逆淬灭。光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。至光漂白区来完成。原理：原理：是研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验是研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验技术之一。技术之一。荧光素标记膜蛋白或膜脂，然后用激光荧光素标记膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射细胞表面某一区域，使被照射区的荧束照射细胞表面某一区域，使被照射区的荧光淬灭变
11、暗。由于膜的流动性，淬灭区域的光淬灭变暗。由于膜的流动性，淬灭区域的亮度逐渐增加，最后恢复到与周围的荧光强亮度逐渐增加，最后恢复到与周围的荧光强度相等。度相等。根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋白或膜脂扩散速度。白或膜脂扩散速度。抗鼠细胞膜蛋白的荧光抗体（显绿色荧抗鼠细胞膜蛋白的荧光抗体（显绿色荧光）和抗人红细胞蛋白的荧光抗体（显红色光）和抗人红细胞蛋白的荧光抗体（显红色荧光）分别标记小鼠和人的细胞表面，然后荧光）分别标记小鼠和人的细胞表面，然后用灭活的仙台病毒处理使两种细胞融合。用灭活的仙台病毒处理使两种细胞融合。10min后不同颜色的荧光在融合细胞表面开后不同颜色
12、的荧光在融合细胞表面开始扩散，始扩散，40min后已分辨不出融合细胞表面后已分辨不出融合细胞表面绿色荧光或红色荧光区域。绿色荧光或红色荧光区域。证明膜蛋白的流动性证明膜蛋白的流动性 透射电镜（透射电镜（TEM）1)超薄切片技术超薄切片技术2)负染色技术负染色技术3)冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术4)真空喷镀技术真空喷镀技术5)电镜三维重构技术电镜三维重构技术 扫描电镜扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）透射电镜的基本构造透射电镜的基本构造 透射电镜主要制样技术透射电镜主要制样技术染色背景，衬托出样品的精细结构。原理是利用schiff试剂与醛基之间的反应，但其醛
13、基来自碘酸氧化多糖的1、2-乙二醇基。三、特异蛋白抗原的定位与定性但四氧化锇渗透缓慢，对酶活性和抗原活性破坏较大。用于传代培养的称为传代细胞。特异蛋白抗原的定位与定性2、扫描电镜（SEM）Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养单克隆抗体（monoclone antibody）技术鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞24小时后，用3H尿嘧啶核苷脉冲标记10分钟的电镜放射自显影图片。放射自显影技术氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸，形成有色复合物。差速离心：利用不同离心速度分离密度不同的细胞组分。动物细胞融合：灭活病毒（如仙台病毒）2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息。1、透射电镜、透射电镜（
14、TEM）显微镜显微镜分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LM200nm可见光可见光玻璃透镜玻璃透镜不要求真空不要求真空利用样品对光的吸利用样品对光的吸收形成明暗反差和收形成明暗反差和颜色变化颜色变化100nm紫外光紫外光玻璃透镜玻璃透镜不要求真空不要求真空TEM0.1nm电子束电子束电磁透镜电磁透镜要求真空要求真空（1.33x10-51.33x10-3Pa）利用样品对电子的利用样品对电子的散射和透射形成明散射和透射形成明暗反差暗反差 电子束穿透力很弱，很难通过细胞、组织切片，电子束穿透力很弱，很难通过细胞、组织切片，样品须先制备超薄切片。样品须先制备超薄切片。超薄切片厚度：
15、超薄切片厚度：4050nm 制备程序：制备程序：取材取材 固定固定 脱水脱水 浸透浸透 包埋包埋 切片切片 染色染色 观察观察用于透射电镜（用于透射电镜（TEM）观观察样本内部超微结构。察样本内部超微结构。戊二醛：是一种化学交联剂，渗透速率较四氧化锇快，戊二醛：是一种化学交联剂，渗透速率较四氧化锇快，能固定蛋白和糖类（特别是糖原）。一般用能固定蛋白和糖类（特别是糖原）。一般用戊二醛进行前固定。但对大多数脂类的固定戊二醛进行前固定。但对大多数脂类的固定作用不强，样品仅用戊二醛固定后，其反差作用不强，样品仅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化锇进行后固定。不好，最好再用四氧化锇进行后固定。常
16、用的固定剂：醛类固定剂、四氧化锇等常用的固定剂：醛类固定剂、四氧化锇等单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和四氧化锇双重固定。四氧化锇双重固定。四氧化锇：是一种重金属化合物，能与不饱和脂肪酸反四氧化锇：是一种重金属化合物，能与不饱和脂肪酸反应，是膜结构最佳固定剂。四氧化锇在随后应，是膜结构最佳固定剂。四氧化锇在随后的脱水过程中可被还原形成锇黑，使样品反的脱水过程中可被还原形成锇黑，使样品反差增强。但四氧化锇渗透缓慢，对酶活性和差增强。但四氧化锇渗透缓慢，对酶活性和抗原活性破坏较大。抗原活性
17、破坏较大。取材与固定取材与固定固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或丙酮进行脱水。丙酮进行脱水。脱水后将样品包埋在树脂中，使之获得一定脱水后将样品包埋在树脂中，使之获得一定的硬度、弹性和韧度，这样才易于切成超薄的硬度、弹性和韧度，这样才易于切成超薄切片，并使切片能承受电子束轰击。切片，并使切片能承受电子束轰击。环氧树脂：国产环氧树脂：国产618618环氧树脂、环氧树脂、Epon812等等脱水脱水包埋包埋常用的包埋剂为环氧树脂和丙烯酸树脂等常用的包埋剂为环氧树脂和丙烯酸树脂等丙烯酸树脂：有丙烯酸树脂：有LR White、LR Gold、Lowi-crvls等
18、等超薄切片一般收集在金属载网上进行超薄切片一般收集在金属载网上进行观察。常用铜网为观察。常用铜网为200200400400目，此外目，此外根据不同的实验要求还可选用金网、根据不同的实验要求还可选用金网、镍网等。镍网等。载网上一般包被一层支持膜，以支撑载网上一般包被一层支持膜，以支撑载网上的超薄切片，增加其稳定性。载网上的超薄切片，增加其稳定性。最常用的支持膜是最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲聚乙烯甲醛醛)、火棉胶、碳等。、火棉胶、碳等。包埋好的组织块需在超薄切片机上用包埋好的组织块需在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。切片切片生物样品多数是由碳、氢、
19、氧、氮等元素组生物样品多数是由碳、氢、氧、氮等元素组成的，这些元素的原子序数低，散射电子的成的，这些元素的原子序数低，散射电子的能力不强，在电镜下的反差非常弱，因此通能力不强，在电镜下的反差非常弱，因此通常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行染色，由于细胞的不同结构对金属盐的亲和染色，由于细胞的不同结构对金属盐的亲和力不同，因此染色后不同结构对电子的散射力不同，因此染色后不同结构对电子的散射能力亦不同，从而增强了细胞结构的反差。能力亦不同，从而增强了细胞结构的反差。常用染色液常用染色液:醋酸双氧铀和铅染液醋酸双氧铀和铅染液电镜观察电镜观察染色与观察染色与观
20、察大鼠骨髓干细胞的超薄切片大鼠骨髓干细胞的超薄切片（引自（引自G.M.Wright et al）染色背景，衬托出样品的精细结构。染色背景，衬托出样品的精细结构。Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens.Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a)or shadow casting with chromium(b).常用染色剂：常用染色剂：2磷磷钨酸水溶液钨酸
21、水溶液（Negative staining）家蚕细小病毒负染色电镜照片家蚕细小病毒负染色电镜照片(病毒直径病毒直径20nm)（陈立华、翟中和）陈立华、翟中和）制备过程简单，只需将样品制成悬液，制备过程简单，只需将样品制成悬液，直接滴于载网上，然后用重金属物质染直接滴于载网上，然后用重金属物质染液染色。即可在液染色。即可在EMEM下观察。下观察。重金属物质散射电子的能力较样品本身重金属物质散射电子的能力较样品本身强，电镜下两者显示出明显的明暗对比，强，电镜下两者显示出明显的明暗对比，样品呈亮色，而其周围的背景将呈暗色，样品呈亮色，而其周围的背景将呈暗色，这样样品表面的微细结构就被衬托出来。这样样
22、品表面的微细结构就被衬托出来。常用染色剂：常用染色剂：2 2磷钨酸水溶液磷钨酸水溶液 真空喷镀一般在喷镀仪中进行，将铂、铬、金真空喷镀一般在喷镀仪中进行，将铂、铬、金等重金属在高真空条件下加热，使其蒸发，蒸等重金属在高真空条件下加热，使其蒸发，蒸发出来的金属粒子以一定的角度斜向喷镀于样发出来的金属粒子以一定的角度斜向喷镀于样品表面，这样凸出的样品表面将比周围背景优品表面，这样凸出的样品表面将比周围背景优先包被一层金属薄膜，二者之间的反差加大，先包被一层金属薄膜，二者之间的反差加大，样品轮廓清晰地显示出来。样品轮廓清晰地显示出来。单方向喷镀，样品向着金属发射源一面沉积金单方向喷镀，样品向着金属发
23、射源一面沉积金属粒子较多，而背侧面较少，形成投影。增强属粒子较多，而背侧面较少，形成投影。增强样品反差，样品富立体感。样品反差，样品富立体感。旋转喷镀，可使样品表面的金属薄膜均匀一致。旋转喷镀，可使样品表面的金属薄膜均匀一致。a a）快速冷冻快速冷冻b b）低温断裂低温断裂c c）蚀刻蚀刻d d）复型复型主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。表面结构。样品在低温下迅速样品在低温下迅速冷冻（液氮或液氦冷冻（液氮或液氦中）和低温下，结中）和低温下，结构构“脆弱脆弱”部位部位（膜脂双分子层疏（膜脂双分子层疏水端）断裂，显示水端）断裂，显示出膜脂中的蛋白质出
24、膜脂中的蛋白质颗粒，真空中冰升颗粒，真空中冰升华，进一步增强华，进一步增强“浮雕浮雕”式蚀刻效式蚀刻效果，铂金喷镀形成果，铂金喷镀形成凹凸电子反差，真凹凸电子反差，真空喷镀碳膜，样品空喷镀碳膜，样品再经消化液消化，再经消化液消化，收集复型膜在电镜收集复型膜在电镜下观察下观察。CO 2临界点干燥法防止临界点干燥法防止主要观察样主要观察样品表面的形品表面的形貌特征。貌特征。温度以上使温度以上使CO2以气态形以气态形式逸去。式逸去。引起样品变形的表面张力问题。常引起样品变形的表面张力问题。常用液态用液态CO2浸透样品，然后在临界浸透样品，然后在临界成像立体感强，一般扫描电镜分辨率为成像立体感强，一般
25、扫描电镜分辨率为3nm。近年来研制的低压高分辨扫描电镜其分辨率可达近年来研制的低压高分辨扫描电镜其分辨率可达0.7nm，可用于观察核孔复合体等更精细结构。，可用于观察核孔复合体等更精细结构。Scanning Tunneling Microscope,STM8080年代发展起来的检测样品微观结构的仪器年代发展起来的检测样品微观结构的仪器包括：包括：STMSTM、AFMAFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等。、磁力显微镜、摩擦力显微镜等。扫描探针与样品接触或达到很近距离时，扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、
26、原子间作中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。电特性或磁特性等。扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。示系统。扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高（侧分辨率为分辨本领高（侧分辨率为0.10.2nm，纵分，纵分辨率可达辨率可达0.01nm）。）。2）可实时得到样品表面
27、三维图象，可测量厚度可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息。信息。3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。非破坏性测量。4）可连续成像，进行动态观察。可连续成像，进行动态观察。纳米生物学研究领域中的重要工具纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上在原子水平上揭示样本表面的结构。揭示样本表面的结构。离心分离技术离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术放射自
28、显影技术 定量细胞化学分析技术定量细胞化学分析技术一、一、离心分离技术离心分离技术用于分离细胞器与生物大分子及其复合物。用于分离细胞器与生物大分子及其复合物。破碎细胞：低渗匀浆、超声波破碎、研磨等。破碎细胞：低渗匀浆、超声波破碎、研磨等。差速离心：利用不同离心速度分离密度不同差速离心：利用不同离心速度分离密度不同的细胞组分。的细胞组分。密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离。离。二、二、细胞内核酸、蛋白质、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类酶、糖与脂类等的显示方法等的显示方法 利用一些显色剂与所检测物质中一利用一些显色剂与所检测物质中一些些特殊基团特殊基团
29、特异性结合的特性，通过显特异性结合的特性，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。断某种物质在细胞中的分布和含量。福尔根染色（福尔根染色（Feulgen Stain）酸水解可除去酸水解可除去RNA，仅保，仅保留留DNA，并，并除去除去DNA上上的嘌呤，使脱的嘌呤，使脱氧核糖的醛基氧核糖的醛基暴露，所暴露暴露，所暴露的自由醛基与的自由醛基与schiff试剂反试剂反应呈紫红色。应呈紫红色。PAS反应可确定多糖存在。原理是利反应可确定多糖存在。原理是利用用schiff试剂与醛基之间的反应，但其试剂与醛基之间的反应，但其醛基来自碘酸氧化
30、多糖的醛基来自碘酸氧化多糖的1、2-乙二醇乙二醇基。基。四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴存在。用以证明脂肪滴存在。氮汞试剂与组织中的蛋氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残白质侧链上的酪氨酸残基反应呈红色。基反应呈红色。检测方法有多种检测方法有多种氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸，形成有色复合物。组氨酸，形成有色复合物。可用硫醇盐共价键的试剂进可用硫醇盐共价键的试剂进行检测。行检测。如检测碱性磷酸酶可用格莫瑞如检测碱性磷酸酶可用格莫瑞（Gomori）方法。）方法。米伦（米伦（Millon）反应）反应重氮反应重氮反
31、应蛋白质蛋白质-SH检测检测酶检测酶检测三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫酶标技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性u 光镜水平的原位杂交技术光镜水平的原位杂交技术（同位素（同位素标记或荧光素标记的
32、探针）标记或荧光素标记的探针）u 电镜水平的原位杂交技术电镜水平的原位杂交技术（生物素（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）胶体金标记结合）u PCR技术技术五、放射自显影技术五、放射自显影技术原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究。物大分子进行定性、定位与半定量研究。应用：实现对细胞内生物大分子进行动态和追应用：实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。踪研究。步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）；冲标记）；放射自显影。
33、放射自显影。鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞24小时后，用小时后，用3H尿嘧啶核苷脉冲标记尿嘧啶核苷脉冲标记10分钟的电镜放射自显影图片。在病毒大量复制与装配的宿主细胞中，分钟的电镜放射自显影图片。在病毒大量复制与装配的宿主细胞中，核仁（核仁（Nu）依然存在，并保持其转录功能依然存在，并保持其转录功能 SG：银颗粒；银颗粒；N：细胞核；细胞核；Nu：核仁；核仁；C：细胞质。细胞质。六、定量细胞化学分析技术六、定量细胞化学分析技术u 细胞显微分光光度术细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，利用细胞内某些物质对特异
34、光谱的吸收，测定这些物质测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法包括：紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法u流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometry）用于定量测定细胞中的用于定量测定细胞中的DNA、RNA或或某一特异蛋白的含量；某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；胞；分离分离DNA含量不同的中期染色体。含量不同的中期染色体。主要应用：主要应用：细胞的培养
35、细胞的培养 细胞工程细胞工程 类型：类型：原代培养细胞（原代培养细胞（primary culture cell）继代培养细胞（继代培养细胞（sub-culture cell）细胞株（细胞株（cell strain）:正常二倍体，接触抑制（是指细胞在生长正常二倍体，接触抑制（是指细胞在生长过程中达到相互接触时停止过程中达到相互接触时停止分裂的现象）分裂的现象）细胞系（细胞系（cell line）：）：亚二倍体，接触抑制丧失亚二倍体，接触抑制丧失 首先从健康动物取出组织块，剪碎，用首先从健康动物取出组织块，剪碎，用胰胰酶或胶原酶与酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）（螯合剂）等将细胞连接等将细胞连接处消
36、化分散，给予良好的营养液与无菌的培养处消化分散，给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内环境（接近体温与体内pH）,在培养瓶中进行在培养瓶中进行静止或慢速转动培养。不论用何种培养液，静止或慢速转动培养。不论用何种培养液，一一般都要加一定量的小牛血清般都要加一定量的小牛血清，这样才有利于细，这样才有利于细胞的贴壁生长与分裂。胞的贴壁生长与分裂。动物原代细胞培养步骤动物原代细胞培养步骤原代细胞（原代细胞（primary cell）传代细胞（传代细胞（sub-culture cell）将肌体取出的细胞或组织进行实效培养。将肌体取出的细胞或组织进行实效培养。实效培养的细胞大约增殖实效培养的细胞
37、大约增殖1010代左右，这样的代左右，这样的细胞称为原代细胞。细胞称为原代细胞。原代培养的细胞继续转接培养称为传原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。用于传代培养的称为传代细胞。代培养。用于传代培养的称为传代细胞。因为可从产生各种不同抗体的各种杂交瘤混合细胞群体中筛选出产生特异抗体的杂交瘤细胞珠。1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高（侧分辨率为0.10min后不同颜色的荧光在融合细胞表面开始扩散，40min后已分辨不出融合细胞表面绿色荧光或红色荧光区域。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。重金属物质散射电子的能力较样品本身强，电镜下两者显示出明显的明暗对比，样品呈亮色，而其
38、周围的背景将呈暗色，这样样品表面的微细结构就被衬托出来。三、特异蛋白抗原的定位与定性 放射自显影技术福尔根染色（Feulgen Stain）主要观察样品表面的形貌特征。细胞系（cell line）：在培养皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；之后，用小鼠骨髓瘤细胞与免疫过小鼠的脾细胞在PEG或灭活病毒介导下发生融合。制备过程简单，只需将样品制成悬液，直接滴于载网上，然后用重金属物质染液染色。将可产生荧光的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因与某种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋白的细胞中，便可直接观察到该蛋白的动态变化。扫描的
39、压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。原代细胞一般传至原代细胞一般传至10代左右就不易传下去代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能渡过亡，但有极少数细胞可能渡过“危机危机”而传而传下去。这些存活的细胞一般又下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传代可顺利地传代40-50次，并且仍次，并且仍保持原来染色体的二倍体数保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞称为细量及接触抑制的行为，这种传代细胞称为细胞株。胞株。细胞株（细胞株（cell strain）：）：能进行无限次传代培养的细胞
40、群能进行无限次传代培养的细胞群形态、结构、遗传上存在不同程度的变异形态、结构、遗传上存在不同程度的变异细胞系（细胞系（cell line）：）：细胞系细胞的特点是染色体明显改变细胞系细胞的特点是染色体明显改变，一般呈一般呈亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，容易传代培养容易传代培养。如。如Hela细胞系、细胞系、BHK21细胞细胞系、系、CHO细胞系等。细胞系等。Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养细胞长梭形细胞长梭形,核圆位核圆位中央中央,胞质常外伸胞质常外伸2-32-3个长个长短突起短突起,多数细胞排列疏多数细胞排列疏散散,有较大细胞间隙有较大细胞间隙
41、,有时有时也相互平行排列，成群细也相互平行排列，成群细胞呈放射状、旋涡状等形胞呈放射状、旋涡状等形式。式。类似上皮细胞而故名。类似上皮细胞而故名。细胞扁平状，排列较规则，细胞扁平状，排列较规则，贴壁后呈三角形及不规则贴壁后呈三角形及不规则扁平多角形，中央有偏圆扁平多角形，中央有偏圆形核，生长时彼此紧密连形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞，相互拥挤接成单层细胞，相互拥挤呈现呈现“铺路石块状铺路石块状”，局，局部可形成单层上皮部可形成单层上皮“膜片膜片组织组织”。在支持物分散生长，在支持物分散生长，一般不连接成片形成群落；一般不连接成片形成群落；细胞质常伸出伪足和突起；细胞质常伸出伪足和突起；在培
42、养皿壁上生长位置不固在培养皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗吞噬颗粒；细胞内易出现色暗吞噬颗粒；细胞外形不规则且多变，细细胞外形不规则且多变，细胞密度增大连接成片时，形胞密度增大连接成片时，形状类似成纤维细胞型或上皮状类似成纤维细胞型或上皮细胞型。细胞型。常见形式：神经细胞和神经胶质细胞。常见形式：神经细胞和神经胶质细胞。细胞多形不规则。细胞多形不规则。其不规则形态不象成其不规则形态不象成纤维细胞那样由胞质纤维细胞那样由胞质突起所致，而是一般突起所致，而是一般分胞体和胞突两部分，分胞体和胞突两部分，
43、胞突细长，胞体多形胞突细长，胞体多形不规则。不规则。细胞体外生长时不贴壁，在悬浮培养液中生细胞体外生长时不贴壁，在悬浮培养液中生长而故名，又称悬浮型细胞。细胞呈球形。长而故名，又称悬浮型细胞。细胞呈球形。常见形式：血液白细胞、淋巴组织细胞、某常见形式：血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交细胞、转化细胞系等。些肿瘤细胞、杂交细胞、转化细胞系等。培养时，细胞密度大，培养效率高，操作方培养时，细胞密度大，培养效率高，操作方便，易于大规模生产。便，易于大规模生产。（1 1）单倍体细胞培养）单倍体细胞培养：用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子（雄性生
44、殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；也可通过愈伤组织诱导分化出芽和根，单倍体植株；也可通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。最终长成植株。（2 2）原生质体培养）原生质体培养 （二倍体体细胞培（二倍体体细胞培养）养）：用纤维素酶去掉细胞壁得到原生质体，后者在用纤维素酶去掉细胞壁得到原生质体，后者在无菌条件下生长分裂，经诱导分化最终长成植株。无菌条件下生长分裂，经诱导分化最终长成植株。也可通过不同植物的原生质体进行融合的体细胞杂也可通过不同植物的原生质体进行融合的体细胞杂交长成体细胞杂交植株。交长成体细胞杂交植株。（1）透射电镜基本构造
45、人、鼠杂交细胞中，人的染色体丢失很快。超薄切片一般收集在金属载网上进行观察。3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；4）冰冻蚀刻技术（Freeze etching）最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲醛)、火棉胶、碳等。可见光显微分光光度测定法第二节 细胞组分的分析方法此时可通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。定量细胞化学分析技术快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲醛)、火棉胶、碳等。用于透射电镜（TEM）观察样本内部超微结构。福尔根染色（Feulgen Stain）80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器包括：STM、A
46、FM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等。细胞培养细胞培养细胞分化的定向诱导细胞分化的定向诱导细胞融合细胞融合显微注射等显微注射等细胞工程使用的主要技术有：细胞工程使用的主要技术有：融合细胞（杂交细胞）在培养过程中会发融合细胞（杂交细胞）在培养过程中会发生染色体丢失。生染色体丢失。凡亲本细胞亲缘关系比较近的，连续培养中凡亲本细胞亲缘关系比较近的，连续培养中染色体丢失慢。人、鼠杂交细胞中，人的染色体染色体丢失慢。人、鼠杂交细胞中，人的染色体丢失很快。丢失很快。两个或多个细胞融合成一个双核或多核两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象称细胞融合。细胞的现象称细胞融合。动物细胞融合：灭活病毒（如仙台病毒
47、）动物细胞融合：灭活病毒（如仙台病毒）聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）植物细胞融合时先要用纤维素酶去掉纤维素植物细胞融合时先要用纤维素酶去掉纤维素壁。壁。电融合技术：悬浮细胞在低压交流电场电融合技术：悬浮细胞在低压交流电场 （100-200V/cm100-200V/cm）中聚集成）中聚集成串珠状细胞群或将相互接触串珠状细胞群或将相互接触的单层培养细胞，加高压脉的单层培养细胞，加高压脉冲促使融合。冲促使融合。u免疫小鼠获得小鼠脾细胞（免疫小鼠获得小鼠脾细胞（B B淋巴细淋巴细胞）。之后，用小鼠骨髓瘤细胞与免胞）。之后，用小鼠骨髓瘤细胞与免疫过小鼠的脾细胞在疫过小鼠的脾细胞在PEGPEG或灭活病
48、毒介或灭活病毒介导下发生融合。融合后的杂交瘤细胞导下发生融合。融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，既可分泌具有两种亲本细胞的特性，既可分泌抗体，也可像肿瘤细胞一样，可在体抗体，也可像肿瘤细胞一样，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。从而分泌大量单克隆抗体。u本技术最主要优点：可用不纯的抗原本技术最主要优点：可用不纯的抗原分子制备纯一的单克隆抗体。因为可分子制备纯一的单克隆抗体。因为可从产生各种不同抗体的各种杂交瘤混从产生各种不同抗体的各种杂交瘤混合细胞群体中筛选出产生特异抗体的合细胞群体中筛选出产生特异抗体的杂交瘤细胞珠。杂交瘤细胞珠。单克隆抗体制备中，单克隆抗体制备中，杂交瘤细胞筛选是关键。杂交瘤细胞筛选是关键。DNA合成途径有两种。合成途径有两种。HAT三种成分与细胞三种成分与细胞DNA合成有关。合成有关。杂交瘤技术中有两种杂交瘤技术中有两种亲本细胞亲本细胞：杂交瘤细胞杂交瘤细胞筛选原理：筛选原理：需培养基筛选：需培养基筛选：HAT选择性培养基选择性培养基H：次黄嘌呤次黄嘌呤 A：氨基碟呤氨基碟呤 T：胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷
