1、.高效液相色谱法高效液相色谱法high performance liquid high performance liquid chromatographychromatography；HPLCHPLCO返回基本要求基本要求掌握：掌握：反相键合相色谱法的分离机制、保留行为的主要反相键合相色谱法的分离机制、保留行为的主要影响因素和分离条件选择；化学键合相的性质、特点和影响因素和分离条件选择；化学键合相的性质、特点和种类及使用注意事项；流动相对色谱分离的影响；种类及使用注意事项；流动相对色谱分离的影响；HPLCHPLC中的速率理论及其对选择实验条件的指导作用；定量分中的速率理论及其对选择实验条件的指
2、导作用；定量分析方法。析方法。熟悉熟悉:反相离子对色谱法和正相键合相色谱法及其分离条反相离子对色谱法和正相键合相色谱法及其分离条件的选择；高效液相色谱仪的部件；紫外检测器和荧光件的选择；高效液相色谱仪的部件；紫外检测器和荧光检测器的检测原理和适用范围。检测器的检测原理和适用范围。了解：了解：离子、手性和亲合三种色谱法；溶剂强度和选择离子、手性和亲合三种色谱法；溶剂强度和选择性；混合溶剂强度参数的计算和流动相最优化方法。性；混合溶剂强度参数的计算和流动相最优化方法。O返回基本内容基本内容18.1 18.1 高效液相色谱法的主要类型和原高效液相色谱法的主要类型和原理理18.2 18.2 高效液相色
3、谱法的固定相和流动高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择相及其选择 18.3 18.3 高效液相色谱仪高效液相色谱仪18.4 18.4 高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法O返回l流动相为液体，采用高效固定相，以高压输送流动相的色谱法。l引入气相色谱的塔板理论和速率理论及先进的实验技术和方法，通过改进固定相达到了高效，采用高压输送流动相，达到了高速。l特点：分离效能高、分析速度快及仪器化next高效液相色谱法高效液相色谱法O返回经典液相色谱法高效液相色谱法（分析型）固定相一般规格特殊规格固定相粒度（m）75500320固定相粒度分布(RSD)2030%5%柱长（cm）101001030柱内
4、径（cm）250.10.5柱入口压强（kg/cm2）0.01120300柱效(每米理论塔片数)10100104105样品用量（g）11010-710-2分析所需时间（h）1200.050.5装置非仪器化仪器化O返回气相色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）应用范围 占有机物的20%占有机物的80%分离效果 高 更高 选 择 性流动相是气体，只能选择固定相 流动相是液体，流动相、固定相都可选择。选择性广。温 度 高温 常温（分离效果好）灵敏度(g/ml)10-12 10-9 O返回一、基本类型一、基本类型吸附色谱法吸附色谱法（adsorption chromatographyadsorption
5、chromatography LSC LSC）分配色谱法分配色谱法（partition chromatographypartition chromatography LLC LLC）离子交换色谱离子交换色谱(ion exchange chromatographyion exchange chromatography IEC)IEC)空间排阻色谱空间排阻色谱(steric exclusion chromatographysteric exclusion chromatography SEC)SEC)O返回化学键合相色谱法化学键合相色谱法（bonded phase chromatographybo
6、nded phase chromatography BPC BPC）离子对色谱法离子对色谱法(paired ion chromatography PIC)(paired ion chromatography PIC)离子抑制色谱法离子抑制色谱法(ion suppression chromatography ISC)(ion suppression chromatography ISC)亲合色谱法亲合色谱法(affinity chromatography AC)(affinity chromatography AC)手性色谱法手性色谱法(chiral chromatography CC)(chi
7、ral chromatography CC)O返回疏溶剂缔合作用示意图l.键合烃基 2.溶剂膜 3.溶质的极性部分 4.溶质的非极性部分 缔缔 和和解缔和解缔和O返回 离子抑制剂：离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质pHpH一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液 酸性物质酸性物质加入酸，如加入酸，如HAcHAc，t tR R，K K 碱性物质碱性物质加入碱，如加入碱，如NHNH3 3HH2 2OO，t tR R，K K 调节调节pHpH范围：范围：2.08.02.08.0适用：适用：pH=37pH=37弱酸；弱酸；pH=78pH=78弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物O返回(2)(2)反相离子对色
8、谱法反相离子对色谱法适用：适用：pH:pH:离子对试剂离子对试剂种类及浓度：种类及浓度：O返回(2)(2)反相离子对色谱法反相离子对色谱法离子对试剂种类及浓度：离子对试剂种类及浓度：适用：适用：pH:pH:O返回O返回一、化学键合相色谱的固定相一、化学键合相色谱的固定相（）液固吸附色谱法（）（）液固吸附色谱法（）固定相常用硅胶、高分子多孔微球固定相常用硅胶、高分子多孔微球O返回一、化学键合相色谱的固定相一、化学键合相色谱的固定相优点：固定液不易流失，稳定（在优点：固定液不易流失，稳定（在pH28pH28范围范围)，热稳定性好，且能用于梯度洗脱。，热稳定性好，且能用于梯度洗脱。硅胶硅胶-烷基键合
9、相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-2-苯酚；苯酚；3-3-乙酰苯；乙酰苯；4-4-硝基苯；硝基苯；5-5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-6-甲苯甲苯键合量评价：键合量评价：含碳量含碳量覆盖度覆盖度封尾封尾O返回要求：要求：与固定液不反应与固定液不反应对样品有良好溶解度对样品有良好溶解度 k=110 k=110 最佳最佳k=25k=25与检测器匹配与检测器匹配粘度小、纯度高。粘度小、纯度高。流动相使用前需用微孔滤膜滤过、脱气。流动相使用前需用微孔滤膜滤过、脱气。O返回(一）流动相对分离的影响一）流动相对分离的影响2211-4nkkR
10、由填由填固充固充定质定质相量相量及决及决色定色定谱谱受受溶溶剂剂种种类类(选择性选择性)影影响响受受溶溶剂剂配配比比(强度强度)影影响响O返回 1 1溶剂的极性和强度溶剂的极性和强度 斯奈德斯奈德(Snyder)(Snyder)溶剂极性参数溶剂极性参数(polarity parameter)(polarity parameter)正相色谱正相色谱 溶剂溶剂极性越强极性越强，洗脱能力越强，是，洗脱能力越强，是强溶剂。强溶剂。反相色谱反相色谱 溶剂溶剂极性越弱极性越弱，洗脱能力越强，是，洗脱能力越强，是强溶剂。强溶剂。强度因子强度因子S S硝基甲烷二氧六环乙醇)lg()lg()lg(gggkkkp
11、O返回O返回正相色谱正相色谱 极性参数极性参数PP反相色谱反相色谱 反相色谱常用溶剂的强度因子反相色谱常用溶剂的强度因子水水甲醇甲醇乙腈乙腈丙酮丙酮二恶烷二恶烷乙醇乙醇异丙醇异丙醇四氢呋喃四氢呋喃0 03.03.03.23.23.43.43.53.53.63.64.24.24.54.5强度因子强度因子S SO返回正相键合相色谱法正相键合相色谱法niiiPP1混式中和为式中和为纯溶剂纯溶剂 i i 的极性参数及该溶的极性参数及该溶剂在混合溶剂中的体积分数。剂在混合溶剂中的体积分数。iiPniiiSS1混2.2.混合溶剂的强度混合溶剂的强度反相键合相色谱法反相键合相色谱法O返回原则原则：控制：控制
12、k=25k=25Xe=lg(Kg)e/P,Xd=lg(Kg)d/P,Xn=lg(Kg)n/P 依据依据：溶剂和溶质间的作用力：溶剂和溶质间的作用力-选择性参数选择性参数O返回 处于同一组中的各溶剂的作用力类型相同，在色谱分离中具有处于同一组中的各溶剂的作用力类型相同，在色谱分离中具有相似的选择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性差别较大。相似的选择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性差别较大。2.14.00.30332200OHCHOHCHHHASSS375.02.3/2.133322CNCHCNCHCNCHOHOHABSSSS四面体法四面体法267.05.4/2.1THF (a)(a)四面体内的
13、等洗脱面四面体内的等洗脱面ABC ABC（b b）等洗脱面中）等洗脱面中1010个初试实验个初试实验 溶溶 剂的配比（剂的配比（A/B/CA/B/C）O返回O返回（一）（一）HPLCHPLC中的速率理论（与中的速率理论（与GCGC对比）对比）GCGC:H=A+B/u+Cu H=A+B/u+Cu (填充柱）填充柱）或或 H=B/u+CuH=B/u+Cu (毛细管柱）毛细管柱）HPLC:HPLC:H=A+CuH=A+CumDB2TDm相相忽忽略略大大，流流动动相相柱柱温温BT O返回2 2）涡流扩散项及其影响因素）涡流扩散项及其影响因素RtnHuuHmlu，但柱效，时，min/1min/1mlu
14、选择兼顾柱效和分析时间，1 1）流动相流速对）流动相流速对HPLCHPLC板高的影响板高的影响dpA2dpA柱效，nHAdpO返回3 3）传质阻抗项及其影响因素）传质阻抗项及其影响因素 smmssmmCCCCCC 柱柱阻阻但但易易产产生生气气泡泡柱柱效效柱柱效效,mmmDTCDTnHDnHCdpuCuCAHHPLCsmm ：mpsmmDdCC2mpDdC2 TDm 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略固定相的传质阻抗固定相的传质阻抗mm：色谱柱及填充情况决定的因子：色谱柱及填充情况决定的因子O返回涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响涡
15、流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响O返回(1)(1)固定相的选择：固定相的选择：小粒度、分布均匀的球形化学键合小粒度、分布均匀的球形化学键合相固定相（相固定相（dp10mdp10m）(2)(2)流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速选粘度小、低流速(1ml/min)(1ml/min)的流动相的流动相甲醇或乙腈甲醇或乙腈 (3)(3)柱温的选择：柱温的选择：一般选室温一般选室温25250 0C C左右左右(4)(4)洗脱方式：等度洗脱洗脱方式：等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）（恒组成溶剂洗脱）梯度洗脱梯度洗脱O返回1贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质)2高压泵（输液泵）3进样
16、装置4色谱柱分离5检测器分析6废液出口或组分收集器 7记录装置O返回.输液泵输液泵:柱塞往复泵柱塞往复泵压力：压力：2050MPa2050MPa。特点：具有压力平稳、脉冲小、特点：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。流量稳定可调、耐腐蚀等特性。O返回.输液泵输液泵:柱塞往复泵柱塞往复泵O返回1.1.等度洗脱等度洗脱洗脱方式洗脱方式 2.2.梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱的优点：缩短分析周期；提高分离梯度洗脱的优点：缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形，很少拖尾；增加检测灵敏度效果；改善峰形，很少拖尾；增加检测灵敏度（因峰变瘦、变高）。但有时引起基线漂移及重复（因峰变瘦、变高）。但有时引
17、起基线漂移及重复性不佳是其缺点。性不佳是其缺点。O返回两种实现梯度洗脱的装置：高压梯度和低压梯度两种实现梯度洗脱的装置：高压梯度和低压梯度O返回 （一）进样器（一）进样器流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：loadloadinjectioninjectionO返回 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径1 16 mm6 mm，柱长，柱长5 540 cm40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。O返回（一）光电二极管阵列检测器（一
18、）光电二极管阵列检测器（PDADPDAD）O返回O返回 定性分析方法定性分析方法 定量分析方法：定量分析方法：外标法、内标法外标法、内标法 同同GCGCO返回 作业：作业：3,13,193,13,19O返回（一）（一）HPLC中的速率理论（与中的速率理论（与GC对比）对比）GC:H=A+B/u+Cu (填充柱）填充柱）或或 H=B/u+Cu (毛细管柱）毛细管柱）HPLC:H=A+CumDB2TDm相相忽忽略略大大，流流动动相相柱柱温温BT O返回2）涡流扩散项及其影响因素）涡流扩散项及其影响因素RtnHuuHmlu，但柱效，时，min/1min/1mlu 选择兼顾柱效和分析时间，1）流动相流
19、速对）流动相流速对HPLC板高的影板高的影dpA2dpA柱效，nHAdpO返回3）传质阻抗项及其影响因素）传质阻抗项及其影响因素 smmssmmCCCCCC 柱柱阻阻但但易易产产生生气气泡泡柱柱效效柱柱效效,mmmDTCDTnHDnHCdpuCuCAHHPLCsmm ：mpsmmDdCC2mpDdC2 TDm 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略固定相的传质阻抗固定相的传质阻抗m：色谱柱及填充情况决定的因子：色谱柱及填充情况决定的因子O返回涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响O返回(1)固定相的选择：固定相的选择：小粒度、分布均匀的球形化学键合小粒度、分布均匀的球形化学键合相固定相（相固定相（dp10m）(2)流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速选粘度小、低流速(1ml/min)的流动相的流动相甲醇或乙腈甲醇或乙腈 (3)柱温的选择：柱温的选择：一般选室温一般选室温250C左右左右(4)洗脱方式：等度洗脱洗脱方式：等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）（恒组成溶剂洗脱）梯度洗脱梯度洗脱
