1、微生物制药微生物制药吴剑波吴剑波 主编主编.分离微生物分离微生物筛选方法的建立筛选方法的建立微生物分类学微生物分类学抗生素发酵（选用不同培养基及培养条件）抗生素发酵（选用不同培养基及培养条件）筛选（采用微生物学、生物化学、生物学或化学方法等筛选（采用微生物学、生物化学、生物学或化学方法等进行测定）进行测定）早期鉴别早期鉴别化合物的分离与纯化化合物的分离与纯化理化性质及生物学性质的测定理化性质及生物学性质的测定采集样品采集样品新物质新物质临床前药理临床前药理临床试验临床试验开发研究开发研究生物合成生物合成作用机制作用机制耐药机制耐药机制全合成全合成结构改造结构改造结构测定结构测定可能为新物质可能
2、为新物质毒性低，疗效好毒性低，疗效好阳性样品阳性样品全发酵液、上清液或菌丝体浸泡液（或粗提品等）全发酵液、上清液或菌丝体浸泡液（或粗提品等）.第第1章章 微生物药物的产生菌微生物药物的产生菌 药物的产生菌；药物的产生菌；新药产生菌的分离；新药产生菌的分离；新微生物药物的筛选。新微生物药物的筛选。.1.1微生物药物的产生菌微生物药物的产生菌 主要包括主要包括放线菌放线菌、真细菌和丝状真菌等。、真细菌和丝状真菌等。1、放线菌、放线菌应用于临床的微生物药物大部分来源于应用于临床的微生物药物大部分来源于放线菌的次级代谢产物放线菌的次级代谢产物。放线菌产生的抗菌药物中化学类别较多。放线菌产生的抗菌药物中
3、化学类别较多。.（1）放线菌产生的抗菌药物）放线菌产生的抗菌药物-内酰胺类内酰胺类 氨基糖苷类氨基糖苷类 大环内酯类大环内酯类 四环素类四环素类 紫霉素类紫霉素类 糖肽类糖肽类 多烯类多烯类 其他抗细菌抗生素其他抗细菌抗生素.产生产生-内酰胺类抗生素的放线菌内酰胺类抗生素的放线菌抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌备注备注头霉素头霉素C耐内酰胺链霉菌耐内酰胺链霉菌（Streptomyces lactamdurans）带小棒链霉菌带小棒链霉菌（Str.clavuligerus）诺卡菌素诺卡菌素A均匀诺卡菌均匀诺卡菌（Nocardia uniformis）硫霉素硫霉素卡特利链霉菌卡特利链霉菌（Str.ca
4、ttleya）由硫霉素半合成的亚胺硫霉素由硫霉素半合成的亚胺硫霉素亚胺培南（亚胺培南（imipenem）在临床）在临床治疗耐药菌感染中有较好疗效治疗耐药菌感染中有较好疗效棒酸棒酸带小棒链霉菌带小棒链霉菌（Str.clavuligerus）抑制青霉素酶抑制青霉素酶橄榄酸橄榄酸橄榄链霉菌橄榄链霉菌（Str.olivaceus）抑制内酰胺酶抑制内酰胺酶.抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌链霉素链霉素streptomycin灰色链霉菌（灰色链霉菌（Str.griseus）枝链霉菌（枝链霉菌（Str.rameus）鲜黄链霉菌（鲜黄链霉菌（Str.galbus）比基尼链霉菌（比基尼链霉菌（Str.bikinie
5、nsis）新霉素新霉素neomycin弗氏链霉菌（弗氏链霉菌（Str.fradiae）巴龙霉素巴龙霉素Paromomycin小串链霉菌小串链霉菌NRRL 2455（Str.catenulae）卡那霉素卡那霉素kanamycin卡那霉素链霉菌（卡那霉素链霉菌（Str.kanamyceticus）庆大霉素庆大霉素gentamicin绛红色小单孢菌绛红色小单孢菌NRRL 2953（Micromonospora purpurea）棘孢小单孢菌棘孢小单孢菌NRRL 2985(M.Echinospora)大观霉素大观霉素spectinomycin壮观链霉菌（壮观链霉菌（Str.spectabilis）产生
6、氨基糖苷类抗生素的放线菌产生氨基糖苷类抗生素的放线菌.产生四环素类抗生素的放线菌产生四环素类抗生素的放线菌抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌四环素四环素tetracycline 生绿链霉菌（生绿链霉菌（Str.viridifaciens）吸水链霉菌（吸水链霉菌（Str.hygroscopicus）氧四环素氧四环素/土霉素土霉素terramycin龟裂链霉菌（龟裂链霉菌（Str.rimosus）褐黄链霉菌（褐黄链霉菌（Str.gilvus）氯四环素氯四环素/金霉素金霉素aureomycin金霉素链霉菌金霉素链霉菌LSB2201（Str.aurofaciens）佐山链霉菌（佐山链霉菌（Str.sayam
7、aensis）具有广谱的抗细菌活性。具有广谱的抗细菌活性。作用于细菌的蛋白质合成。作用于细菌的蛋白质合成。产生菌均为链霉菌。产生菌均为链霉菌。.产生大环内酯类抗生素的放线菌产生大环内酯类抗生素的放线菌抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌红霉素红霉素erythromycin红霉素链霉菌红霉素链霉菌ER-598,2135（Str.erythreus）灰平链霉菌（灰平链霉菌（Str.griseoplanus）竹桃霉素竹桃霉素oleandomycin抗生链霉菌抗生链霉菌ATCC11891（Str.antibioticus）麦迪加霉素麦迪加霉素midecamycin生米卡链霉菌（生米卡链霉菌（Str.mycar
8、ofaciens）螺旋霉素螺旋霉素产二素链霉菌（产二素链霉菌（Str.ambofacoensis）.抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌备注备注两性霉素两性霉素amphotericin节状链霉菌节状链霉菌M-4575（Str.nodosus）七烯大环内酯类，抗真七烯大环内酯类，抗真菌抗生素菌抗生素制霉菌素制霉菌素nystatin诺尔斯链霉菌诺尔斯链霉菌ATCC 11455（Str.noursei）四烯大环内酯类，抗丝四烯大环内酯类，抗丝状真菌和酵母样真菌状真菌和酵母样真菌多烯类抗生素产生菌主要是链霉菌，作用于真菌，多烯类抗生素产生菌主要是链霉菌，作用于真菌，能与真菌细胞膜中的固醇结合，使膜受损，影响能
9、与真菌细胞膜中的固醇结合，使膜受损，影响细胞正常代谢，导致细胞死亡。细胞正常代谢，导致细胞死亡。产生多烯类抗生素的放线菌产生多烯类抗生素的放线菌.抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌备注备注利福霉素利福霉素rifamycin地中海拟无枝酸菌地中海拟无枝酸菌ME/83（Amycolatopsis maditerranei）利福霉素及其衍生物有利福霉素及其衍生物有广谱的抗菌活性，可用广谱的抗菌活性，可用于抗结核杆菌，作用于于抗结核杆菌，作用于细菌细菌RNA多聚酶多聚酶氯霉素氯霉素chloramphenicol委内瑞拉链霉菌委内瑞拉链霉菌（Str.venezuelae）氯霉素是广谱抗细菌抗氯霉素是广谱抗细菌
10、抗生素，抑制蛋白质合成生素，抑制蛋白质合成磷霉素磷霉素forfomycin弗氏链霉菌弗氏链霉菌NRRL-3417（Str.fradiae）磷霉素抑制细胞壁合成，磷霉素抑制细胞壁合成，对对G+和和G-细菌均有抗细菌均有抗菌活性菌活性环丝氨酸环丝氨酸cycloserine兰花链霉菌兰花链霉菌（Str.orchidaceus）环丝氨酸抑制细胞壁合环丝氨酸抑制细胞壁合成，对成，对G+、G-细菌和细菌和结核分枝杆菌均有抗菌结核分枝杆菌均有抗菌作用作用长崎链霉菌长崎链霉菌（Str.nagasakiensis）产生其他抗细菌抗生素的放线菌产生其他抗细菌抗生素的放线菌.蒽环类蒽环类糖肽类糖肽类色霉素类色霉素类
11、烯二炔类烯二炔类丝裂烷类丝裂烷类其他抗肿瘤抗生素其他抗肿瘤抗生素（2）放线菌产生的抗肿瘤药物）放线菌产生的抗肿瘤药物.蒽环类抗生素产生菌蒽环类抗生素产生菌道诺霉素道诺霉素daunomycin波塞链霉菌波塞链霉菌FI-1762（Str.peuceticus）天蓝微红链霉菌天蓝微红链霉菌NRRL3046（Str.coeruleorubidus）阿霉素阿霉素adriamycin波塞链霉菌青灰变种波塞链霉菌青灰变种IMRU3920（Str.Peuceticus var.caesius）洋红霉素洋红霉素carminomycin洋红马杜拉放线菌（洋红马杜拉放线菌（Actinomadura carminat
12、a）以发色团插入以发色团插入DNA双螺旋中而与双螺旋中而与DNA结合，抑制依结合，抑制依赖于赖于DNA的的RNA多聚酶，抑制多聚酶，抑制RNA合成和合成和DNA复制复制.糖肽类抗生素产生菌糖肽类抗生素产生菌博来霉素博来霉素bleomycin轮枝链霉菌（轮枝链轮丝菌）轮枝链霉菌（轮枝链轮丝菌）（Streptoverticillum verticillus）平阳霉素平阳霉素pingyangmycin轮枝链轮丝菌平阳变种轮枝链轮丝菌平阳变种（Streptoverticillum verticillus var.pingyangense）博安霉素博安霉素boanmycin轮枝链轮丝菌平阳变种轮枝链轮丝
13、菌平阳变种（Streptoverticillum verticillus var.pingyangense）与与DNA结合，使结合，使DNA单链断裂，抑制胸单链断裂，抑制胸腺嘧啶进入腺嘧啶进入DNA中，终止癌细胞的分裂中，终止癌细胞的分裂.色霉素类抗生素色霉素类抗生素 与与DNA结合，抑制依赖于结合，抑制依赖于DNA的的RNA多聚多聚酶酶色霉素色霉素橄榄产色链霉菌橄榄产色链霉菌69895（Str.olivochromogenes）光神霉素光神霉素白泥链霉菌白泥链霉菌ATCC12957（Str.argillaceus）烯二炔类抗生素烯二炔类抗生素 活化后形成芳香环二自由基，切断活化后形成芳香环二
14、自由基，切断DNA链，链，抑制了抑制了DNA的合成的合成新制癌霉素新制癌霉素neocarzinostatin抑癌链霉菌新抑癌亚种（抑癌链霉菌新抑癌亚种（Str.Carzinostaticus subsp.neocarzinostaticus）丝裂烷类抗生素丝裂烷类抗生素 能使互补的能使互补的DNA双链之间形成交联，从而抑双链之间形成交联，从而抑制制DNA的合成的合成丝裂霉素丝裂霉素头状链霉菌头状链霉菌NRRL2564（Str.caespitoseus）.抗肿瘤药物抗肿瘤药物产生菌产生菌放线菌素放线菌素Dactinomycin抗生素链霉菌（抗生素链霉菌（Str.antibiotics）小小链霉菌
15、（小小链霉菌（Str.parvullus）链黑菌素链黑菌素streptonigrin团片链霉菌团片链霉菌ATCC13257（Str.flocculus）杀霉链霉菌杀霉链霉菌ATCC13853（Str.fungicidicus）链脲菌素链脲菌素streptozotocin不产色链霉菌不产色链霉菌NRRL2697（Str.achromogenes）吡唑呋喃菌素吡唑呋喃菌素pyrazofurin纯白链霉菌（纯白链霉菌（Str.candidus）其他抗肿瘤抗生素其他抗肿瘤抗生素.药物药物产生菌产生菌备注备注乌苯美司乌苯美司（bestatin）橄榄网状链霉菌橄榄网状链霉菌（Streptomyces ol
16、ivoreticuli）免疫抑制剂，并对多种免疫抑制剂，并对多种肿瘤有免疫治疗作用肿瘤有免疫治疗作用藤霉素藤霉素（fujimycin,）链霉菌链霉菌（S.tsukubaenis）有抗真菌活性，大环内有抗真菌活性，大环内酯类免疫抑制剂酯类免疫抑制剂雷帕霉素雷帕霉素（rapamycin）吸水链霉菌吸水链霉菌（S.hygroscopicus）三烯大环内酯类免疫抑三烯大环内酯类免疫抑制剂，有抗真菌活性制剂，有抗真菌活性康乐霉素康乐霉素C（kanglemycin C）地中海诺卡菌康乐变种地中海诺卡菌康乐变种（Nocardia mediterranei var.kanglensis）免疫抑制剂免疫抑制剂（
17、3）其他药物产生菌）其他药物产生菌.抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌备注备注杆菌肽杆菌肽bacitracin枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）地衣形芽孢杆菌（地衣形芽孢杆菌（B.licheniformis）黏菌素黏菌素colistin多粘芽孢杆菌黏菌素变种多粘芽孢杆菌黏菌素变种（B.polymyxa var.colistinus）多粘菌素多粘菌素polymycin多粘芽孢杆菌（多粘芽孢杆菌（B.polymyxa）丁酰苷菌素丁酰苷菌素butirosin环状芽孢杆菌环状芽孢杆菌NRRL B-3313（B.circulans）氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素磺酰胺菌素磺酰胺
18、菌素sulfazecin嗜酸假单胞菌嗜酸假单胞菌（Pseudomonas acidophila）单环单环-内酰胺类抗内酰胺类抗生素生素单菌胺素单菌胺素monobactams紫色色杆菌紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）单环单环-内酰胺类抗内酰胺类抗生素生素硝吡咯菌素硝吡咯菌素pyrrolnitrin吡咯假单胞菌吡咯假单胞菌2327（P.pyrrocinia）堆囊菌素堆囊菌素sorangicin纤维素堆囊菌纤维素堆囊菌(Sorangium cellulosum)大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素琥苍菌素琥苍菌素ambruticin纤维素堆囊菌（纤维素堆囊菌（S.cell
19、ulosum）抗真菌作用抗真菌作用2、细菌、细菌.真菌是第一个应用于临床的抗生素真菌是第一个应用于临床的抗生素青霉素的产生菌，并青霉素的产生菌，并从此进入了抗菌治疗中的抗生素时代。从此进入了抗菌治疗中的抗生素时代。抗菌药物抗菌药物产生菌产生菌备注备注青霉素青霉素penicillin点青霉（点青霉（Penicillum notatum）产生菌很多，多数菌种产生菌很多，多数菌种属于青霉属。属于青霉属。对细菌有抗菌作用，抑对细菌有抗菌作用，抑制细菌细胞壁合成。制细菌细胞壁合成。产黄青霉（产黄青霉（Pen.chrysogenum）巴恩青霉（巴恩青霉（Pen.baarnense）矮小青霉（矮小青霉（Pe
20、n.humuli）黄曲霉（黄曲霉（Aspergillus flavus）构巢曲霉（构巢曲霉（Asp.nidulans）头孢菌素头孢菌素C cephalosporin C顶头孢霉顶头孢霉（Cephalosporium acremonium）对细菌有抗菌作用，抑对细菌有抗菌作用，抑制细菌细胞壁合成。制细菌细胞壁合成。灰黄霉素灰黄霉素griseofulvin灰黄青霉（灰黄青霉（Pen.griseofulvum）产生菌较多，均为青霉产生菌较多，均为青霉属属;作用于微孔蛋白，抑作用于微孔蛋白，抑制真菌生长制真菌生长詹氏青霉詹氏青霉250（Pen.janczewskii）3、真菌、真菌.药物药物产生菌产生
21、菌其他其他环孢菌素环孢菌素A cyclosporinA光泽柱孢菌光泽柱孢菌（Cylindrocarpon lucidum）有抗真菌活性，其结有抗真菌活性，其结构为构为11个氨基酸的环个氨基酸的环肽肽雪白白疆菌雪白白疆菌（Beauveria bassiana）腐皮镰刀菌腐皮镰刀菌4-11（Fusarium solani）洛伐他汀洛伐他汀lovastatin土曲霉土曲霉（Aspergillus）抑制胆固醇生物合成抑制胆固醇生物合成4、其他药物产生菌、其他药物产生菌.ONSCH3CH3COORHHRCONH天然青霉素天然青霉素.二二 新药产生菌的分离新药产生菌的分离（一）土壤微生物的分离（一）土壤微
22、生物的分离土壤是微生物的重要栖息地。土壤是微生物的重要栖息地。1.采集样品采集样品2.分离微生物分离微生物3.选留菌种及保存选留菌种及保存u分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。u土壤样品通常采表层土（土壤样品通常采表层土（5cm以下），样品以下），样品以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的土壤。理和生态环境的土壤。.2.分离微生物分离微生物.利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线
23、菌孢子间的耐性差异，用放线菌孢子间的耐性差异，用物理或化学物理或化学的方法的方法除去细菌及目的外放线菌，或者用除去细菌及目的外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。出率。.处理条件处理条件样品样品分离的放线菌分离的放线菌40，216 h土壤、植土壤、植物根物根链霉菌链霉菌55，6 min水、土壤、水、土壤、粪便粪便小单孢菌、链霉菌、红球菌、小单孢菌、链霉菌、红球菌、嗜酸放线菌和嗜碱放线菌等嗜酸放线菌和嗜碱放线菌等55干热，干热，10 d土壤土壤高温放线菌高温放线菌100干热，干热，15 min 土壤土壤马杜拉放线菌马杜拉放线菌100120干
24、热，干热，1 h土壤土壤马杜拉放线菌、小双孢菌，小马杜拉放线菌、小双孢菌，小四孢菌，孢囊链霉菌四孢菌，孢囊链霉菌温度温度-分离前样品加热处理分离前样品加热处理.化学试剂的处理化学试剂的处理 SDS-酵母膏处理法酵母膏处理法，SDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明显减少。数明显减少。风干的土壤与风干的土壤与CaCO3混合混合后在后在26培养培养79 d，然后分离，然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，CaCO3有利于放有利于放线
25、菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。用用0.01 mol/L NaOH处理处理土壤土壤510 min（15）可减少细）可减少细菌的数量，有利于分离小单孢菌。菌的数量，有利于分离小单孢菌。用用1.4%酚酚处理处理土样土样10 min或用或用1.4%酚酚130处理处理30 min，分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯用乙酸乙酯或氯仿和苯处理处理样品，过滤风干后用来分离微样品，过滤风干后用来分离微生物，可以除去样品中的真菌。生物，可以除去样品中的真菌。.物理方法的处理物理方法的处理 离心，离心，1600 g离心离心20
26、 min，上清液主要有放线菌孢子，沉，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。淀含有细菌和真菌孢子。超声波处理超声波处理，分离小单孢菌和链霉菌。分离小单孢菌和链霉菌。特殊器具捕集特殊器具捕集空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。搅动搅动，使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。膜过滤膜过滤，将水经膜（孔径将水经膜（孔径0.45um滤膜）过滤，浓缩水中微滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。诱饵法诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发在培养基中
27、添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。等，可分离小瓶菌和发仙菌。.合成培养基合成培养基精氨酸培养基，高氏合成一号培养精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等基，天门冬素培养基，察氏培养基等 有机培养基有机培养基Waksman培养基，培养基，Bennett培养基培养基 几丁质培养基几丁质培养基只有放线菌能够利用几丁质，生只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分培养基上加以区分 HV培养基培养基以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基培养基
28、.选择性分离放线菌所使用的培养基选择性分离放线菌所使用的培养基马杜拉放线菌属马杜拉放线菌属葡萄糖，甘油，葡萄糖，甘油，L-天冬酰胺，微量盐，维天冬酰胺，微量盐，维生素（生素（AV培养基）培养基）小双孢菌属小双孢菌属AV培养基培养基小单孢菌属小单孢菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）培养基）小四孢菌属小四孢菌属下层：葡萄糖，下层：葡萄糖，L-天冬酰胺，微量盐天冬酰胺，微量盐上层上层：（水解）酪蛋白氨基酸水解）酪蛋白氨基酸诺卡菌属诺卡菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）培养基）嗜高温放线菌属嗜高温放线菌属半浓度营养琼脂半浓度营养琼脂链孢囊菌属
29、链孢囊菌属葡萄糖，葡萄糖，L-天冬胺酰，微量盐（天冬胺酰，微量盐（NH2），），维生素，土壤浸出液维生素，土壤浸出液各种菌属各种菌属胶体几丁质，微量盐胶体几丁质，微量盐.加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的落的rose bengal等），抑制真菌生长；等），抑制真菌生长；加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率；制细菌生长，增加放线菌的分出率；加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离
30、到一定种类的放线菌。如新生霉利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。素有利于分离北里孢菌属。.最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。接喷在分离平板上。将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进行分离培养。行分离培养
31、。将将0.220.45um的滤膜放在分离平板上，接种的滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。去掉滤膜，深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。.一般培养温度为一般培养温度为2530，也有，也有3237，培养培养714 d，生长慢的放线菌可延长培，生长慢的放线菌可延长培养养1个月；个月；分离高温放线菌用分离高温放线菌用4550培养培养12 d；海水放线菌用海水放线
32、菌用20培养培养6周左右。周左右。.稀有放线菌的特征：稀有放线菌的特征：生长速度比较缓慢；生长速度比较缓慢；营养需求较为复杂；营养需求较为复杂；比较缺乏孢子分化的能力；比较缺乏孢子分化的能力；不能稳定保存。不能稳定保存。.分离几种稀有放线菌的方法分离几种稀有放线菌的方法稀有放线稀有放线菌种类菌种类形态特征形态特征预处理方预处理方法法分离方法分离方法分离方法分离方法的特征的特征马杜拉放马杜拉放线菌线菌100加热加热15 min，并悬浮于并悬浮于无菌的无菌的25（V/V）Ringers溶溶液中液中悬浮液涂悬浮液涂布于含有布于含有100 ug/mL放线菌酮、放线菌酮、25 ug/mL利福平的利福平的
33、固体培养固体培养基上基上高温处理高温处理土样与使土样与使用含有利用含有利福平的固福平的固体培养基体培养基相结合的相结合的选择性分选择性分离方法离方法.稀有放线稀有放线菌种类菌种类形态特征形态特征预处理方预处理方法法分离方法分离方法分离方法分离方法的特征的特征游动放线游动放线菌菌不形成真正不形成真正的气生菌丝，的气生菌丝，并且菌落呈并且菌落呈鲜艳的橘黄鲜艳的橘黄色。营养菌色。营养菌丝上形成孢丝上形成孢子囊。游动子囊。游动孢子由成熟孢子由成熟的孢子囊产的孢子囊产生。生。土样浸泡土样浸泡于饱和的于饱和的硫酸镁盐硫酸镁盐溶液中，溶液中，再洗去镁再洗去镁盐，干燥盐，干燥土样。土样。将经过干将经过干湿处理
34、后湿处理后的土样涂的土样涂布于几丁布于几丁质琼脂上，质琼脂上，可得到大可得到大量的游动量的游动放线菌放线菌利用了生利用了生物趋化方物趋化方法法分离几种稀有放线菌的方法分离几种稀有放线菌的方法.稀有放线稀有放线菌种类菌种类形态特征形态特征预处理预处理方法方法分离方分离方法法分离方法分离方法的特征的特征小单孢菌小单孢菌 大多数种缺乏气生大多数种缺乏气生菌丝，形成橘黄色菌丝，形成橘黄色或橘红色的菌落孢或橘红色的菌落孢子；分化的菌落表子；分化的菌落表面变成黑色或暗褐面变成黑色或暗褐色，有时呈光滑或色，有时呈光滑或粘稠。单孢子只在粘稠。单孢子只在营养菌丝上形成，营养菌丝上形成，没有运动性。没有运动性。碱
35、处理碱处理有效的有效的降低了降低了革兰氏革兰氏阴性细阴性细菌的生菌的生长长含有衣含有衣霉素的霉素的固体培固体培养基可养基可选择性选择性的支持的支持小单孢小单孢菌的生菌的生长长将土样进将土样进行碱处理行碱处理和使用含和使用含有衣霉素有衣霉素的固体培的固体培养基相结养基相结合的独特合的独特方法方法分离几种稀有放线菌的方法分离几种稀有放线菌的方法.稀有放线稀有放线菌种类菌种类形态特征形态特征预处理预处理方法方法分离方法分离方法分离方法分离方法的特征的特征诺卡菌诺卡菌大多数种形成蜡大多数种形成蜡样的或有光泽的样的或有光泽的菌落而不形成气菌落而不形成气生菌丝，但也有生菌丝，但也有一些种会产生不一些种会产
36、生不成熟的气生菌丝，成熟的气生菌丝，营养菌丝可断裂营养菌丝可断裂成球状或杆状片成球状或杆状片断断用石蜡用石蜡棒在土棒在土壤样品壤样品的悬液的悬液中富集中富集然后将石然后将石蜡从棒上蜡从棒上剥离，接剥离，接种到种到DST（Oxoid）琼脂平板琼脂平板上，上，25 培养培养3 w分离几种稀有放线菌的方法分离几种稀有放线菌的方法.稀有放线稀有放线菌种类菌种类形态特征形态特征预处理方预处理方法法分离方法分离方法分离方法分离方法的特征的特征链孢囊菌链孢囊菌营养和气生菌营养和气生菌丝与链霉菌菌丝与链霉菌菌株一样发育良株一样发育良好，包含着不好，包含着不能移动孢子的能移动孢子的孢囊位于气生孢囊位于气生菌丝的
37、顶端菌丝的顶端可先将土可先将土样在室温样在室温风干，然风干，然后在后在120 加热加热1 h将处理后将处理后的土样或的土样或用土壤悬用土壤悬液涂布于液涂布于含有维生含有维生素的培养素的培养基上基上分离几种稀有放线菌的方法分离几种稀有放线菌的方法.稀有放线稀有放线菌种类菌种类形态特征形态特征预处理预处理方法方法分离方分离方法法分离方法分离方法的特征的特征北里孢菌北里孢菌属属形态特征以及菌落形态特征以及菌落特征与链霉菌属非特征与链霉菌属非常相似，但它们的常相似，但它们的细胞壁中含有细胞壁中含有LL-DAP、meso-DAP、甘氨酸、半乳糖，甘氨酸、半乳糖，与链霉菌属完全不与链霉菌属完全不同同50
38、ug/mL新生霉新生霉素的培素的培养基养基利用了北利用了北里孢菌属里孢菌属菌种对新菌种对新生霉素具生霉素具有抗性的有抗性的特征特征分离几种稀有放线菌的方法分离几种稀有放线菌的方法.真菌的真菌的分离分离常用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、常用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、Martin培养基、察培养基、察氏蔗糖（葡萄糖）琼脂培养基，氏蔗糖（葡萄糖）琼脂培养基，pH偏酸性。偏酸性。为了抑制细菌的生长一般在分离培养基中加入为了抑制细菌的生长一般在分离培养基中加入-内内酰胺类和氨基糖苷类等抗生素。酰胺类和氨基糖苷类等抗生素。细菌的细菌的分离分离常用有机培养基，如牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、营常用有机培养基，如牛肉膏蛋白胨
39、琼脂培养基、营养琼脂加氨基酸维生素的培养基等，养琼脂加氨基酸维生素的培养基等，pH偏碱性。偏碱性。分离时一般加入一定量的抗真菌抗生素如制霉菌素、分离时一般加入一定量的抗真菌抗生素如制霉菌素、两性霉素、放线菌酮等，抑制真菌生长，有利于细两性霉素、放线菌酮等，抑制真菌生长，有利于细菌分离。菌分离。加入多粘菌素可大大减少加入多粘菌素可大大减少G细菌生长，使细菌生长，使G细菌细菌得以富集。得以富集。.3.选留菌种及保存选留菌种及保存.（二）海洋微生物的分离（二）海洋微生物的分离.目的目的从海水和海底沉淀物中分离放线菌从海水和海底沉淀物中分离放线菌分离的样品分离的样品 用采样器采集海水和海底沉淀物用采样
40、器采集海水和海底沉淀物前处理前处理离心和过滤海水达到浓缩，沉淀物直离心和过滤海水达到浓缩，沉淀物直接涂平板接涂平板培养基培养基各种培养基，包括含人造海水的一些各种培养基，包括含人造海水的一些培养基（淀粉水解酪蛋白海水）培养基（淀粉水解酪蛋白海水）培养培养20，6 w挑选菌落挑选菌落挑出全部放线菌菌落挑出全部放线菌菌落结果结果有几株产生新抗生素的菌种，包括沉有几株产生新抗生素的菌种，包括沉淀物中得到的产生淀物中得到的产生aplasmomycin的的Str.griseusOkami等从海洋中分离放线菌的程序等从海洋中分离放线菌的程序.（3）普通分离放线菌培养基适当稀释，）普通分离放线菌培养基适当稀
41、释，再加入人造海水再加入人造海水蛋白胨蛋白胨5 g磷酸铁磷酸铁0.1 g酵母膏酵母膏1 g人造海水人造海水 1000 ml琼脂琼脂1.7%pH7.6分离海洋放线菌的培养基分离海洋放线菌的培养基（1）SC培养基：培养基：可溶性淀粉可溶性淀粉10 g酪蛋白酪蛋白1 g人造海水人造海水500 ml蒸馏水蒸馏水500 ml琼脂琼脂1.7%pH7.4（2）Z培养基：培养基：.（三）极端微生物的分离（三）极端微生物的分离极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、高压等）中形成的一类特殊的微生物，因高碱、高压等）中形成的一类特殊的微生物，因而在分离这类微生
42、物时，需考虑它们生长繁殖所而在分离这类微生物时，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设计分离与培养条件。需的特殊条件，以设计分离与培养条件。分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长温度高达分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长温度高达80，pH在在1-6；分离嗜盐微生物时培养基中的盐浓度可高达分离嗜盐微生物时培养基中的盐浓度可高达2.5 mol/L。.粘细菌粘细菌基因重组微生物基因重组微生物利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物的基因重组微生物，逐步创立的基因重组微生物，逐步创立组合生物合成组合生物合成。利用基因重组微生物提高已有抗生素的产量和利用基因重组微生物
43、提高已有抗生素的产量和有效组分的含量。有效组分的含量。纤维素堆囊菌（纤维素堆囊菌（Sorangium cellulosum）大环内酯类抗生素堆囊大环内酯类抗生素堆囊菌素，菌素，琥苍菌素（抗真菌）琥苍菌素（抗真菌）（四）其他微生物资源（四）其他微生物资源.组合生物合成组合生物合成将产生不同抗菌药物将产生不同抗菌药物或其他生理活性中间体的基因重组到一或其他生理活性中间体的基因重组到一种微生物中，使其生物合成途径重新组种微生物中，使其生物合成途径重新组合，生产迄今自然界还没有的新的抗生合，生产迄今自然界还没有的新的抗生素或生理活性化合物。素或生理活性化合物。.（五）难培养微生物的分离与培养研究（五）
44、难培养微生物的分离与培养研究VBNC（viable but nonculturable）指那些可培指那些可培养的不分化的微生物在受到外界压力刺激后，通养的不分化的微生物在受到外界压力刺激后，通过一系列的类似分化的遗传程序而使过一系列的类似分化的遗传程序而使自身处于一自身处于一种能抵抗饥饿和压力的状态种能抵抗饥饿和压力的状态；尽管此后；尽管此后不能用常不能用常规的培养方法恢复其生长繁殖规的培养方法恢复其生长繁殖，但实验证明它们，但实验证明它们仍仍保持生存力与致病因子和保持生存力与致病因子和/或基因或基因。.三三.新微生物药物的筛选新微生物药物的筛选（一）初筛发酵（一）初筛发酵初筛发酵是能否产生抗
45、初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选生素的关键，需要选择适合的发酵培养基择适合的发酵培养基和培养条件，以利于和培养条件，以利于抗生素的合成。抗生素的合成。.碳源碳源糖类、脂肪、某些有机酸、糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物醇或碳氢化合物供给微生物生命活动供给微生物生命活动所需要的能量以及构所需要的能量以及构成菌体细胞成分和代成菌体细胞成分和代谢产物。谢产物。氮源氮源蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、肉膏、酒泥粉、玉米浆、肉膏、酒泥硫酸铵、氨水、硝酸盐等硫酸铵、氨水、硝酸盐等供给微生物生长所需供给微生物生长所需的氮素，构成菌体原的氮素，构成菌体原生质生质无机盐、无
46、机盐、微量元微量元素素磷、镁、钾、钠等磷、镁、钾、钠等铁、铜、锌、锰、钴、钼等铁、铜、锌、锰、钴、钼等可以作为生理活性物可以作为生理活性物质的组成或生理活性质的组成或生理活性作用的调节物作用的调节物培养基成分培养基成分培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料.初筛方式初筛方式 固体平板发酵固体平板发酵便于大量筛选抗菌物质便于大量筛选抗菌物质时采用。时采用。液体振荡培养液体振荡培养放线菌大都为好氧菌，放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。合成。.10000株新分离的放线菌株新分离的放线菌3
47、0株（可能是新抗生素）株（可能是新抗生素）10种新化合物种新化合物1种有希望的化合物，低毒性，体内有效种有希望的化合物，低毒性，体内有效新抗生素新抗生素/分离的菌株数：分离的菌株数：1/1000新抗生素新抗生素/已知抗生素：已知抗生素：1/50有希望的抗生素有希望的抗生素/分离的菌株数：分离的菌株数：1/100002500株对细菌有抗菌活性株对细菌有抗菌活性500株株250株链丝菌素类株链丝菌素类125株链霉素类株链霉素类40株四环素类株四环素类55株其他已知抗生素株其他已知抗生素交叉耐药试验和纸层鉴别交叉耐药试验和纸层鉴别毒性试验毒性试验.1.常规的筛选方法常规的筛选方法 琼脂扩散法琼脂扩散
48、法利用利用多种微生物多种微生物作为检定作为检定菌，筛选有抗菌活性菌，筛选有抗菌活性的物质。的物质。非致病菌非致病菌 抗生素耐药突变株和抗生素耐药突变株和超敏菌株超敏菌株 厌氧菌厌氧菌 协同活性检测协同活性检测.q以作用机理为依据的筛选方法以作用机理为依据的筛选方法q以耐药机制为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法2.定靶筛选定靶筛选从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生作用强
49、、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。素。.（1）以作用机理为依据的筛选方法）以作用机理为依据的筛选方法细菌细胞壁合成抑制剂的筛选；细菌细胞壁合成抑制剂的筛选；细菌叶酸代谢抑制剂的筛选；细菌叶酸代谢抑制剂的筛选；蛋白质合成抑制剂的筛选；蛋白质合成抑制剂的筛选；细菌细菌DNA回旋酶抑制剂的筛选；回旋酶抑制剂的筛选；改变细胞膜通透性药物的筛选；改变细胞膜通透性药物的筛选；作用于细菌外膜的药物的筛选；作用于细菌外膜的药物的筛选；作用于细菌外排泵的药物的筛选；作用于细菌外排泵的药物的筛选；作用于非甲羟戊酸生物合成途径的筛选；作用于非甲羟戊酸生物合成途径的筛选；氨基糖苷类抗生素的筛选氨基糖苷类抗生素的筛选.
50、细菌细胞壁合成抑制剂的筛选细菌细胞壁合成抑制剂的筛选土壤分离的微生物（土壤分离的微生物（10200株）（细菌、真菌和放线菌）株）（细菌、真菌和放线菌）第二步：第二步：测定抑制同位素渗入测定抑制同位素渗入meso-3H二氨基庚二酸二氨基庚二酸L-14C亮氨酸亮氨酸用用Diaflo UM-2膜测定相对膜测定相对分子质量（分子质量（1000以下）以下）小分子量：小分子量：azureomycin A和和B（新）（新）AM-1034AM-5289Amphomycin，青霉素，青霉素G大分子量：大分子量：ristocetin A 和和B其他（其他（11种）种）+-+-+（487）（238）（1530）+-
