1、观念的改变观念的改变o 有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。应建立起来的。o 近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueous enzymology)non-aqueous enzymology)。观念的改变观念的改变新酶促反应体系新酶促反应体系的发现的发现,拓宽了酶催化反应的应用范围拓宽了酶催化反应的应用范围,使酶使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的合成方法法合成逐步发展成为与化学
2、法合成相互补充的合成方法;Margolin Margolin 等研究了在等研究了在无水吡啶无水吡啶中以枯草杆菌蛋白酶为催化剂的中以枯草杆菌蛋白酶为催化剂的选择性酰化反应该反应可以得到选择性酰化反应该反应可以得到1 1 位选择性酰化产物位选择性酰化产物;传统的化传统的化学法是无法区分这些二级羟基的学法是无法区分这些二级羟基的,显示了酶法合成的优越性显示了酶法合成的优越性.非水溶剂（有机介质）中酶催化的研究非水溶剂（有机介质）中酶催化的研究2020世纪初，世纪初，BourquelotBourquelot等人，将微量乙醇、丙酮类有机溶等人，将微量乙醇、丙酮类有机溶剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水
3、溶液中低得多剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水溶液中低得多19661966年以来，年以来，Dostoli Dostoli 和和SiegelSiegel分别报道胰凝乳蛋白酶和分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力1975-19831975-1983年，年，BucklandBuckland和和MartinekMartinek等探讨了微生物细胞、等探讨了微生物细胞、游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成脂和类固醇及缁醇转游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成脂和类固醇及缁醇转化化19841984年年KlibanovKlibanov
4、在在ScienceScience上发表关于酶在有机介质上发表关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，中催化条件和特点的综述，标志着该领域的研究取得突破标志着该领域的研究取得突破性进展性进展酶在有机介质中的催化的确立酶在有机介质中的催化的确立19841984年美国年美国Klibanov A.M.Klibanov A.M.在在Science上上发表了一篇关于酶在有机介质中催化发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，在仅含微量水的条件和特点的综述，在仅含微量水的有机介质中成功酶促合成了酯、肽、有机介质中成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。手性醇等许多有机化合物。Klibanov
5、A.M.结论：结论：只要条件合适，酶可在非生物体系的疏水介质中催只要条件合适，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶可化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶可在水与有机剂互溶体系、水与有机剂量组成的双液在水与有机剂互溶体系、水与有机剂量组成的双液相体系、仅含微量水或几乎无水的有机剂中表现出相体系、仅含微量水或几乎无水的有机剂中表现出催化活性。催化活性。为什么酶在有机溶剂中表现出催化活性？为什么酶在有机溶剂中表现出催化活性？通过酶在水相和有机相中的结构比较，通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了在有机相中酶能够保持其整体证实了在有机相中酶能够保持其整体结构
6、的完整性，至少是酶活性部位与结构的完整性，至少是酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。水溶液中的结构是相同的。不同介质中酶活性中心的完整性相差不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差不大，但酶活力却相差4 4个数量级。个数量级。因此认为酶分子结构的动态变化很可因此认为酶分子结构的动态变化很可能是主要因素能是主要因素.北口博司认为酶分子的北口博司认为酶分子的“紧密紧密”和和“开启开启”两种状态处于一种可动平衡两种状态处于一种可动平衡中，表现出一定柔性。中，表现出一定柔性。有机溶剂中酶分子和水合作用、蛋白有机溶剂中酶分子和水合作用、蛋白质柔性和酶活力之间和关系比过去的质柔性和酶活力之间和
7、关系比过去的认识要复杂得多。认识要复杂得多。酶结合水酶结合水酶酶水或有机剂水或有机剂第一节第一节 酶非水相催化的研究概况酶非水相催化的研究概况受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同酶的非水相催化类型主要包括酶的非水相催化类型主要包括:o 一、有机介质的酶催化；一、有机介质的酶催化；o 二、气相介质的酶催化；二、气相介质的酶催化；o 三、超临界流体介质中的酶催化；三、超临界流体介质中的酶催化；o 四、离子液介质中的酶催化四、离子液介质中的酶催化go有机介质的酶催化有机介质的酶催化o 指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反指酶在含有一定水的有机溶剂中进
8、行催化反应应;o 适用范围适用范围:底物或产物或其一为疏水性物质底物或产物或其一为疏水性物质的酶催化作用的酶催化作用;o 原因原因:酶在有机相中能保持结构的完整酶在有机相中能保持结构的完整;o 特性特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；o 应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。合成、手性药物拆分的研究。如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应：如多酚氧化酶催化酚类物质的氧化反应：水果、蔬菜的褐变就是由于果蔬类中含酚类物质和多酚氧化
9、水果、蔬菜的褐变就是由于果蔬类中含酚类物质和多酚氧化酶，破损时与氧气接触，发生上述反应而变为褐色。因此，酶，破损时与氧气接触，发生上述反应而变为褐色。因此，在水相中无法得到邻醌类化合物或邻酚类物质；在水相中无法得到邻醌类化合物或邻酚类物质；但在氯仿中酶催化反应生成的邻醌类化合物不易发生聚合，但在氯仿中酶催化反应生成的邻醌类化合物不易发生聚合，从而可得到邻醌类化合物。因此研究非水相酶催化反应很有从而可得到邻醌类化合物。因此研究非水相酶催化反应很有必要。必要。气相介质的酶催化气相介质的酶催化o 指酶在气相介质中进行催化反应；指酶在气相介质中进行催化反应；o 适用范围：底物是气体或能转化为气体的物适
10、用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；质；o 特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水相中明显不同；相中明显不同；有优于液相反应的优点有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；产；Hwang Hwang 等研究了固定化醇
11、氧化酶在气相中的催化反应等研究了固定化醇氧化酶在气相中的催化反应生物酶用于气相催化不适用于糖氨基酸等不易挥发的底物生物酶用于气相催化不适用于糖氨基酸等不易挥发的底物但它将来可用于某些易挥发产品的工业生产以及有害气体但它将来可用于某些易挥发产品的工业生产以及有害气体的分析和处理的分析和处理Back超临界流体介质中的酶催化超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行催化反应；酶在超临界流体中进行催化反应；超临界流体超临界流体指温度和压力超过临界点的流体；指温度和压力超过临界点的流体；supercriticalsupercritical状态，简称状态，简称SC SC 状态；状态；由于黏度、介电常数、
12、扩散系数和溶解能力都与密度有关，因由于黏度、介电常数、扩散系数和溶解能力都与密度有关，因此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的物理化学性质。此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的物理化学性质。与常用的有机溶剂相比，超临界流体特别是与常用的有机溶剂相比，超临界流体特别是SCCOSCCO、SCHSCH2 2O O还是还是一种环境友好的溶剂。一种环境友好的溶剂。要求：要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。不可太高太低；压力不可太高；易获得等。常用的超临界流体有：常用的超临界流体有：COCO2
13、 2,SO,SO2 2 C C2 2H H4 4,C,C2 2H H6 6 C C3 3H H8 8 C C4 4H H1010 等。等。指酶在离子液中进行催化作用；酶在有机溶剂中活力低的原因在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为pH-imprinting;适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质；有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；生物柴油的燃点是柴油的两倍，因此使用、处理、运输和储藏都极其安全；意义:酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主要是选择
14、立体异构的醇.如果用化学方法聚合，需要将有些羟基保护起来，避免副反应，聚合后，再脱保护，反应过程复杂，还有异构体产生，酶法聚合则不必保护基团，反应条件温和。酶分子处在反胶束内，稳定性好；1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等例：Rubion报道P.有机相的固定化载体与方法的选择与在水相中的不同，最重要的是要满足酶在有机相反应中的微观环境，有利于酶的分散和稳定；因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.20世纪初，Bourquelot等人，
15、将微量乙醇、丙酮类有机溶剂加到酶的水溶液中，酶有活性，但比水溶液中低得多液体燃料的不足已严重威胁到我国的能源与经济安全；例4：蛋白质工程和抗体酶技术有机溶剂中 酶含水量最适水量，酶构象过于“柔性”，因变构而失活；有机溶剂中 酶含水量38300整个酶分子被一层单分子水层包整个酶分子被一层单分子水层包围酶活力是水溶液中的围酶活力是水溶液中的/10。2.2.水对酶催化反应速度的影响水对酶催化反应速度的影响 o 典型的非水酶体系中水含量通常只占典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%0.01%，但，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。o 水影响蛋白质结构的完
16、整性、活性位点的极性和水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。稳定性。有机溶剂中有机溶剂中 酶含水量酶含水量 最适水量，酶构象过于最适水量，酶构象过于“柔性柔性”，因变，因变构而失活；构而失活；最适水量：最适水量：蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间的最蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间的最佳点平衡点，酶活性最大，保证酶的极性部位水合，表现酶活佳点平衡点，酶活性最大，保证酶的极性部位水合，表现酶活力所必需力所必需同一种酶，反应系统的最适水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、同一种酶，反应系统的最适水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质核修饰性质有关固定化酶的载体性质核
17、修饰性质有关有机介质中含两类水：结合水、游离水；有机介质中含两类水：结合水、游离水；在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大；在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大；然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响；然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响；为了排除溶剂对最适含水量的影响，为了排除溶剂对最适含水量的影响，HallingHalling建议用水活度（建议用水活度（a aw w）描述）描述有机介质中酶催化活力与水的关系：有机介质中酶催化活力与水的关系：水活度：水活度：体系中水的逸度与纯水逸度之比；体系中水的逸度与纯水逸
18、度之比；用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示；用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示；Aw=P/PoAw=P/Po P P：一定条件下体系中水的蒸汽压：一定条件下体系中水的蒸汽压 Po:Po:相同条件下纯水的蒸汽压相同条件下纯水的蒸汽压水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用水水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用水活度作参数更确切；活度作参数更确切；3.3.水活度（水活度（activity of water)activity of water)三三 有机溶剂对有机介质中酶催化的影响有机溶剂对有机介质中酶催化的影响有机溶剂影响有机溶剂
19、影响o 有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用:o 一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活;o 二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行常反应的进行;o 三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用1.1.有机溶剂对酶结构与功能的影响有机溶剂对酶结构与功能的影响在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液
20、中，较好在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象；地保持其构象；有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同。也有不同。有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏；有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏；有的酶分子则保持完整；有的酶分子则保持完整；（1 1）由于酶分子与溶剂的直接接触，蛋白质分子）由于酶分子与溶剂的直接接触，蛋白质分子表面结构发生不可忽视的变化；表面结构发生不可忽视的变化；（2 2）通过减少整个活性中心的数量，溶剂对酶的）通过减少整个活性
21、中心的数量，溶剂对酶的活性中心产生影响，活性中心数目丧失的多少取活性中心产生影响，活性中心数目丧失的多少取决于溶剂中的疏水性大小。决于溶剂中的疏水性大小。WhyWhy？溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶剂为非极性，影响更明显，溶剂分子能渗透入酶剂为非极性，影响更明显，溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心的极性，增加酶与底的活性中心，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力。物的静电斥力。（1）有机溶剂对结合水的影响）有机溶剂对结合水的影响o 一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面的必需水而导致酶失活。的必需
22、水而导致酶失活。o 酶失水的情况与溶剂的介电常数和疏水性参酶失水的情况与溶剂的介电常数和疏水性参数有关。数有关。o 由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关。量与酶的用量及底物浓度有关。2.2.有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂对酶活性的影响酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价修饰酶分子表面可增加表面疏水性使酶均一溶于有机剂中提高酶催化效率与稳定性。有机溶剂中的酶能够“记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的PH，pH记忆，pH印记;包括水解酶、氧化还原酶、醛缩酶等十几种酶均可在有机剂中催化；生物柴油的优点主要有：1.非线性光学材料
23、是激光技术的重要物质基础，在激光倍频、混频、参量放大与振荡、集成光学、光信息处理与光信号控制、光电子计算机等方面有重要应用；水在酶催化反应中发挥着双重作用:蛋白酶 肽合成 合成多肽2、利用嗜热菌蛋白酶生产天苯肽；原因：在有机溶剂中酶分子表面的必需水只要在特定的PH和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因才能处于最佳的离子化状态是有机溶剂和微量水组成的反应体系;不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样；因此研究非水相酶催化反应很有必要。意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；例4：蛋白质工程和抗体酶技术N-乙酰-L丝氨酸乙酯原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子；1%以下，而在乙酸乙酯和微水组成
24、的两相系统中，合成率可达100%。已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反应和氧化反应。有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；例：Rubion报道P.（2）溶剂属性）溶剂属性(极性极性)与酶活力的定量关系与酶活力的定量关系酶在不同的有机溶剂中活力差别很大；酶在不同的有机溶剂中活力差别很大；研究最多的是酶活力与溶剂极性参数研究最多的是酶活力与溶剂极性参数lgPlgP之间的关之间的关系；系；P P：指溶剂在正
25、辛烷与水两相中的分配系数，：指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数，lgPlgP越越大，极性越小；大，极性越小；Laane Laane 的实验发现：的实验发现：lgP2lgP4lgP4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想，酶具有较高活力，此类溶剂较理想 。2lgP42lgP4，酶活力中等。，酶活力中等。、溶剂对底物和产物分配的影响、溶剂对底物和产物分配的影响o 溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。o 溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。度。有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性
26、底物难于进入必需水层；进入必需水层；有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低；有机溶剂中溶解度太低；故选择故选择2 2lgp5的有机溶剂作为有机介质为宜。的有机溶剂作为有机介质为宜。o YangYang等发现：溶剂对底物和产物的影响主要体等发现：溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物溶剂化上，从而影响反应动力现在底物和产物溶剂化上，从而影响反应动力学和热力学平衡。学和热力学平衡。第三节第三节 酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性o 有机溶剂的存在有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平改变了疏水相互作用的精细平衡衡,
27、从而影响到酶的结合部位从而影响到酶的结合部位.o 有机溶剂会改变底物存在状态有机溶剂会改变底物存在状态.o 结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选立体选择性择性,区域选择性和化学键选择性区域选择性和化学键选择性.一、底物专一性一、底物专一性o 有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变态发生改变,致使酶的底物特异性发生改变致使酶的底物特异性发生改变;o 水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用;o 有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强
28、;N-乙酰-L丝氨酸乙酯N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水性疏水性:介质介质水水辛烷辛烷蛋白酶蛋白酶水解速度水解速度底物底物底物专一性底物专一性(续续)o 不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样；不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样；o 极性较强的有机溶剂中极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反疏水性较强的底物易反应应;o 极性较弱的有机溶剂中极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反疏水性较弱的底物易反应应;N-N-乙酰乙酰-L-L丝氨酸乙酯丝氨酸乙酯N-N-乙酰乙酰-L-L-苯丙氨酸乙酯苯丙氨酸乙酯疏水性疏水性:二氯甲烷二氯甲烷吡啶吡啶枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶+丙醇丙醇(极性较强极性
29、较强)底物底物介质介质反应速度反应速度二、对映体选择性（二、对映体选择性（enantioselectivity)o 又称立体选择或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋又称立体选择或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小指标；化合物中识别一种异构体的能力大小指标；立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强立体选择系数：立体选择系数：有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲介质的亲(疏疏)水性的变化水性的变化而发生改变。而发生改变。酶在水溶液中立体选择性强，疏水性强的有机溶剂中的酶的立体选择
30、性差。酶在水溶液中立体选择性强，疏水性强的有机溶剂中的酶的立体选择性差。这种选择性是由底物的两种对映体把水分子从酶分子疏水结合位置换出来的能力这种选择性是由底物的两种对映体把水分子从酶分子疏水结合位置换出来的能力不同；不同；介质的疏水性加大，介质的疏水性加大，L L型底物置换水的过程在热力学上不利。型底物置换水的过程在热力学上不利。原因原因o 溶剂的几何形状溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性，如也影响酶的对映体选择性，如OttolinaOttolina报道一些脂肪酶、蛋白酶在（报道一些脂肪酶、蛋白酶在（R R）-香芹酮香芹酮及（及（S S）-香芹酮中立体选择性不同；香芹酮中立体选择性不同；o
31、 对映体选择性对映体选择性意义意义：o 蛋白酶在水溶液中对蛋白酶在水溶液中对L-L-氨基酸起作用，而在有机介氨基酸起作用，而在有机介质中可用质中可用D-D-氨基酸为底物合成手性药物，有重要应氨基酸为底物合成手性药物，有重要应用。用。三、区域选择性（三、区域选择性（regioselectivityregioselectivity）酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应；用区域选择系数应；用区域选择系数KrsKrs的大小衡量。的大小衡量。与立体选择系数相似，用与立体选择系数相似，用1 1、2 2代替构型；代替构型；反应的位置选择因
32、子：反应的位置选择因子：K K1 1，2 2=（k kcatcat/K/Km m)1 1/（k kcatcat/K/Km m)2 2例：例：1,4-二丁酰基二丁酰基-2-辛基苯辛基苯丁醇丁醇脂肪酶脂肪酶转脂反应转脂反应+甲苯甲苯乙腈乙腈K4，120.5（kcat/Km）1/（kcat/Km）2与溶剂的疏水性相关与溶剂的疏水性相关 例：例：RubionRubion报道报道P.cepaciaP.cepacia脂肪酶脂直接反应，脂肪酶脂直接反应，K K1 1，2 2与与溶剂的疏水性常数溶剂的疏水性常数lgPlgP有较好的相关性有较好的相关性abc疏水疏水介质介质亲水亲水介质介质蛋白酶 肽合成 合成多
33、肽其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。是有机溶剂和微量水组成的反应体系;七、pH值和离子强度的控制多酚氧化酶 氧化 芳香化合物羟基化1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；有机介质中含两类水：结合水、游离水；非线性光学材料：酶法合成的聚酚类物具有较高的三阶非线性光学系数X（3）1986年Klibanov小组首先开展了有机相中酶结合成糖酯的研究。有机溶剂中的酶能够“记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的PH，pH记忆，pH印记;羟基化酶 氧化 甾体转化有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到
34、一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系；酶在不同的有机溶剂中活力差别很大；微量水主要是酶分子结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要;酶催化合成可生物降解高分子其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或多相体系；辣根过氧化物酶催化酚及芳香胺
35、类物质的聚合3特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变；四、键选择性（四、键选择性（chemoselectivity)o 即同一个底物分子中有即同一个底物分子中有2 2种以上化学键可与酶种以上化学键可与酶反应，酶对其一优先反应；反应，酶对其一优先反应；6-6-氨基氨基-1-1-已醇已醇黑曲霉脂肪酶黑曲霉脂肪酶毛霉脂肪酶毛霉脂肪酶羟基酰化羟基酰化氨基酰化氨基酰化占优占优意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；o TawakiTawaki等人发现反应介质对某些氨基醇的丁酰化的化等人发现反应介质对某些氨基醇的丁酰化的化学键选择性（
36、学键选择性（O-O-酰化与酰化与N-N-酰化）有很大影响；酰化）有很大影响；o 化合物与丁酸三氯化乙酯的酰化反应在叔丁醇中和在化合物与丁酸三氯化乙酯的酰化反应在叔丁醇中和在1 1，2 2二氯乙烷中的酰化程度不同；二氯乙烷中的酰化程度不同；酰酰化化度度不不同同五、五、热力学稳定性热力学稳定性有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高；有机溶剂中酶有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高；有机溶剂中酶的热稳定性还与介质中水含量有关；的热稳定性还与介质中水含量有关；原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子；原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子；KlibanovKlibano
37、v和和VolkinVolkin认为：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，由认为：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，由水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。六六.pH.pH值特性值特性o 有机溶剂中的酶能够有机溶剂中的酶能够“记忆记忆”在冷冻干燥或丙酮沉淀在冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的前所在缓冲液中的PHPH，pHpH记忆，记忆，pHpH印记印记;o 现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反应，现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反应，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的PHPH密切相关，密切相关，反应的
38、最适反应的最适PHPH接近于水溶液中的最适接近于水溶液中的最适PHPHo 原因：在有机溶剂中酶分子表面的必需水只要在特定原因：在有机溶剂中酶分子表面的必需水只要在特定的的PHPH和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因才能和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因才能处于最佳的离子化状态处于最佳的离子化状态o 检测：根据缓冲液中磷原子的核磁共振谱的变化核利检测：根据缓冲液中磷原子的核磁共振谱的变化核利用分子探针技术，可以检测酶从缓冲液中冷冻干燥或用分子探针技术，可以检测酶从缓冲液中冷冻干燥或有机溶剂沉淀后，转入吸水有机溶剂中的有机溶剂沉淀后，转入吸水有机溶剂中的PHPHo 在有机介质中酶所处的在有机
39、介质中酶所处的pHpH环境与酶在冻干或吸附到载体环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液上之前所使用的缓冲液pHpH值相同，称为值相同，称为pH-imprinting;pH-imprinting;o 当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在有机介质中；不变，被保持在有机介质中；o 有机介质中酶催化反应的最适有机介质中酶催化反应的最适phph通常与在水溶液的通常与在水溶液的pHpH接接近；近；o 但有些有机溶剂中酶的最但有些有机溶剂中酶的最PHPH与水溶液中相差较大，还与与水溶液中相差较大，还与缓冲液种类和离子强度有关缓
40、冲液种类和离子强度有关;o 可用有机相缓冲液可用有机相缓冲液(疏水性酸与对应盐或疏水性碱与对应疏水性酸与对应盐或疏水性碱与对应盐）控制酶的解离状态，消除酶盐）控制酶的解离状态，消除酶pHpH印记特性的影响；印记特性的影响；第四节第四节 有机介质中酶催化反应的有机介质中酶催化反应的条件及其控制条件及其控制o 酶在有机介质中的催化反应受各种因素酶在有机介质中的催化反应受各种因素影响，主要有酶、底物、有机溶剂种类、影响，主要有酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度、水含量、温度、pHpH值和离子强度等。值和离子强度等。一、有机介质中酶催化反应的类型一、有机介质中酶催化反应的类型1 1、合成反应、合成反
41、应(linklink)2 2、转移反应、转移反应(link)3 3、醇解反应、醇解反应(link)4 4、氨解反应、氨解反应(link)5 5、异构反应、异构反应(link)6 6、氧化还原反应、氧化还原反应(link)7 7、裂合反应、裂合反应(link)go1、合成反应、合成反应有机介质中水含量极微，可催化水解反应的逆反应；有机介质中水含量极微，可催化水解反应的逆反应；（1 1）脂肪酶或酯酶催化有机酸和醇进行酯的合成反应：）脂肪酶或酯酶催化有机酸和醇进行酯的合成反应：意义意义:酶催化酯合成可合成手性化合物酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇
42、要是选择立体异构的醇.（2 2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多肽肽back又称立体选择或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小指标；超临界流体介质中的酶催化HRP可催化酚类物质与天然的树脂材料木质素混聚形成酚树脂。要求：超临界流体对酶结构无破坏；（2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多肽三、超临界流体介质中的酶催化；生物柴油可生物降解，无毒性，对环境无害，并可以从可再生资源中提取。非线性光学材料是激光技术的重要物质基础，在激光倍频、混频、参量放大与振荡、集成光学、光信息处理与光信
43、号控制、光电子计算机等方面有重要应用；用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸碱下高温（230250）催化转酯反应,生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，在经洗涤干燥即得生物柴油,生产设备与一般制油设备相同,后处理复杂，废酸碱二次污染；有优于液相反应的优点：某些酶在液相中使用受到一定的限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应就可以克服这些缺点，而且气相中的酶促反应更利于易挥发性产品的生产；同一种酶，反应系统的最适水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质核修饰性质有关三、超临界流体介质中的酶催化；适用范围:底物或产物或其一为疏水性物质的酶催化作用;
44、1、水对酶分子空间构象的影响已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反应和氧化反应。HRP在催化合成聚合物方面是一种应用较多，潜力较大的酶，HRP能够以过氧化氢为电子受体，专一地催化酚及苯胺类物质的过氧化反应。枯草杆菌蛋白酶经6个定点突变，在二甲基甲酰胺中稳定性提高50倍；溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。水在酶催化反应中发挥着双重作用:由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或多相体系；酶分子处在反胶束内，稳定性好；有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层；2、转移反应、转移反应o 如脂肪酸催化酯与有机酸反应生成另一种酯与有机酸如脂肪酸催化酯与有机酸反
45、应生成另一种酯与有机酸,即即转酯反应转酯反应：back3、醇解反应、醇解反应o 假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物即酸酐水解反应即酸酐水解反应,例例:back4、氨解反应、氨解反应如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应：如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应：R-R-苯丙氨酸甲酯苯丙氨酸甲酯酰胺酰胺叔丁醇叔丁醇环氧化合物氨解环氧化合物氨解back5、异构反应、异构反应o 如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体例例back6、氧化还原反应、氧化还原反应o（1 1）单加氧）单加氧(linklink)o（2 2）双加氧）双加氧(
46、linklink)o（3 3）催化醛类或酮类还原成醇类）催化醛类或酮类还原成醇类(linklink)back（1 1）单加氧）单加氧back（2 2）双加氧）双加氧（3 3）催化醛类或酮类还原成醇类）催化醛类或酮类还原成醇类7 7、裂合反应、裂合反应o 如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应back二、酶的选择二、酶的选择o 1 1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；处理法不同特性亦有差别；o 2 2、酶反应速度与酶浓度成正比；、酶反应速度与酶浓度成正比；o 3 3、另注意酶的稳定性、底物专一性、另注意
47、酶的稳定性、底物专一性,对映体选择对映体选择性、区域选择性、键选择性等性、区域选择性、键选择性等例例1：印迹酶：印迹酶o 利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的有结合该配体及其类似物能力的“新酶新酶”；o KlibonovKlibonov等根据酶在有机溶剂中具有等根据酶在有机溶剂中具有“刚性刚性”的特点，的特点，发展此修饰酶技术；发展此修饰酶技术；o 方法：枯草杆菌蛋白酶从含配体方法：枯草杆菌蛋白酶从含配体N-AC-TyrNHN-AC-TyrNH2 2（竞争性抑（竞争性抑制剂）的缓冲液中沉淀，干燥，除配体后放
48、入无水有机制剂）的缓冲液中沉淀，干燥，除配体后放入无水有机剂中，配体剂中，配体印印迹酶活性比无配体时冷冻干燥的酶高迹酶活性比无配体时冷冻干燥的酶高100100倍；倍；o印印迹酶在水中的活性与未迹酶相同；迹酶在水中的活性与未迹酶相同；o 控制好控制好“印印迹酶迹酶”在有机剂中最适含水量，可用生物在有机剂中最适含水量，可用生物印印迹法调节控制酶在有机剂中的催化活性和选择性。迹法调节控制酶在有机剂中的催化活性和选择性。例例2：化学修饰酶：化学修饰酶o 原理：原理：o 酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价修饰酶分子表面可增加表面疏水性使酶均一修饰酶分子表面可增加
49、表面疏水性使酶均一溶于有机剂中提高酶催化效率与稳定性。溶于有机剂中提高酶催化效率与稳定性。o 例：例：o 稻田佑二用单氧甲基聚乙二醇共价修饰脂肪稻田佑二用单氧甲基聚乙二醇共价修饰脂肪酶、过氧化酶等蛋白质表面自由氨基，修饰酶、过氧化酶等蛋白质表面自由氨基，修饰酶能均一溶于苯和氯仿等有机剂中。酶能均一溶于苯和氯仿等有机剂中。3、利用芳香醛脱氢酶生产香兰素；酶在冷冻干燥过程中，pH状态有变化；可通过调节缓冲液pH和离子强度的方法调节有机介质中酶催化的pH值和离子强度；亦可以控制反应速率和反应平衡；方法有：多孔玻璃、硅藻土等吸附，载体表面共价交联；酶催化合成可生物降解高分子印迹酶在水中的活性与未迹酶相
50、同；Why？溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶剂为非极性，影响更明显，溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力。利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”；酶一般不溶于有机剂中，双亲分子或非共价修饰酶分子表面可增加表面疏水性使酶均一溶于有机剂中提高酶催化效率与稳定性。利用酶与配体的相互作用，诱导改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”；其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。通过酶在水相和有机相中的结构比较，证实了在有机相中酶能够
