1、菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养q 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证；q 从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物约为自然界总数的1-5%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；q 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。一、一、第1页/共63页从自然界中分离菌种的一般过程第2页/共63页第3页/共63页第4页/共63页第5页/共63页第6页/共63页第7页/共63页第8页/共63页第9页/共63页第10页/共63页第11页/共63页第12页/共63页v工业上重要的酵母菌工业上重要的酵母菌v 啤酒酵母啤酒酵母(酒精、啤酒等酒精、啤酒等)v 假丝酵母假丝酵母(单
2、细胞蛋白、柠檬酸、脂肪酸、石油脱蜡单细胞蛋白、柠檬酸、脂肪酸、石油脱蜡)。第13页/共63页第14页/共63页第15页/共63页一一些些抗生素生产有关的微生物放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源第16页/共63页氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌氨基酸生产有关的微生物第17页/共63页食品工业微生物 包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的
3、仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌 和地衣芽孢杆菌第18页/共63页第19页/共63页第20页/共63页出发菌株的选择菌悬液的制备前培养诱变处理变异菌株的分离和筛选第21页/共63页例例v 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。v由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。第22页/共63页第23页/共63页第24页/共63页基因的直接进化育种基因的直接进化育种q 突变
4、 基因突变库的建立基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤：在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。第25页/共63页q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q不是病原菌，产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）生产特性要符合工艺要求，培养条件易于控制，生长迅速、发酵周期短工工业业第26页/共63页质代谢和生长繁殖能力下降，发酵周期延长，抗不良环境条件的性能减弱等衰
5、衰退退的的原原因：因：内因：基因突变，变异菌株性状分离外因：菌种保藏不妥；菌种的生长条件要求没有得到满足；或遇到不利的条件，或失去某些需要的条件等；菌种的连续传代是菌种退化的主要原因防防止止衰衰退退的的方方法：法：合理培养条件，减少传代次数复复壮：壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件纯菌纯菌种种自发突变自发突变不纯菌种不纯菌种突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体第27页/共63页工工业业微微或或斜斜面面传传代代保保藏；藏；(3)矿矿物物油油保保藏；藏；(4)土土壤壤或或陶陶瓷瓷珠珠等等载载体体干干燥燥保保藏。藏。保保藏藏原原则：则：选选择择优优良良纯纯种、种、创创造造休休眠眠环环境境
6、保保藏藏要要求：求：保保持持菌菌种种优优良良特特性，性，经经济济方方便便保保藏藏后后需需再再次次检检测测和和确确定定保保藏藏菌菌种种的的形形态态学学和和生生化化特特征征(如如代代谢谢产产物物的的产产生、生、酶酶活活力、力、遗遗传传特特征征及及生生化化指指标标)。第28页/共63页代代谢谢活活动动停停止止分分类：类：普普通通冷冷冻冻保保藏藏(-20)超超低低温温冷冷冻冻保保藏藏(-60一一-80)液液氮氮冷冷冻冻保保藏藏(-156)特特点：点：简简单单有有效效培培养养物物运运输输较较困困难难第29页/共63页种种的的一一般般方方法法是：是：1离离心心收收获获对对数数生生长长中中期期至至后后期期的
7、的微微生生物物细细胞胞2用用新新鲜鲜培培养养基基重重新新悬悬浮浮所所收收获获的的细细胞；胞；3加加入入等等体体积积的的20甘甘油油或或10二二甲甲亚亚砜；砜；4混混匀匀后后分分装装入入冷冷冻冻指指管管或或安安瓿瓿中，中，于于-70超超低低温温冰冰箱箱中中保保藏。藏。超超低低温温冰冰箱箱的的冷冷冻冻速速度度一一般般控控制制在在1 1-2 2m mi in n。一一些些细细菌菌和和真真菌菌菌菌种种可可保保藏藏5 5年年而而活活力力不不受受影影响。响。第30页/共63页结结的的细细胞胞悬悬液液中中的的水水分分升升华，华，使使培培养养物物干干燥。燥。此此法法是是微微生生物物菌菌种种长长期期保保藏藏的的
8、最最为为有有效效的的方方法法之之一。一。特特点：点：冻冻干干状状态态下下一一般般可可保保藏藏10年年不不丧丧失失活活力力冻冻干干后后的的菌菌株株可可常常温温保保存，存，便便于于运运输输必必须须使使用用冷冷冻冻保保护护剂，剂，常常用用脱脱脂脂乳、乳、蔗蔗糖糖等等第31页/共63页箱，箱，三三个个月月以以下下保保存，存，供供试试验验用用矿矿物物油油保保藏：藏：将将琼琼脂脂斜斜面面或或液液体体培培养养物物浸浸入入矿矿物物油油中中于于室室温温下下保保藏，藏，简简便便有有效，效，可可用用于于丝丝状状真真菌、菌、酵酵母、母、细细菌菌和和放放线线菌菌的的保保藏。藏。特特别别用用于于难难以以冷冷冻冻干干燥燥的
9、的丝丝状状真真菌菌和和难难以以在在固固体体培培养养基基上上形形成成孢孢子子的的担担子子菌菌载载体体保保藏：藏：麦麦壳，壳，砂砂土土灭灭菌菌后后可可用用作作载载体体第32页/共63页方法名称方法名称主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评价评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法石蜡油封藏法*沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥法冷冻干燥法低温低温低温低温低温、缺氧低温、缺氧干燥、无营养干燥、无营养干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、有保护剂温、有保护剂各大类各大类细菌、酵母菌细菌、酵母菌各大类各大类*产孢子微生物产孢子微生物各大类各大类36月月61
10、2月月12年年110年年515年年以上以上简便简便简便简便简便简便简便简便简便简便、有、有效效第33页/共63页种子：种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。二、二、第34页/共63页种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满
11、足要求q 生理状况稳定，保持稳定的生产能力生理状况稳定，保持稳定的生产能力q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染无杂菌污染第35页/共63页第36页/共63页床种子罐第37页/共63页第38页/共63页种子培养的方法第39页/共63页第40页/共63页中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。第41页/共63页第42页/共63页第43页/共63页第44页/共63页第45页/共63页接种龄与接种量接种龄与接种量第46页/共63页接种龄与接种量接种龄与接种量第47页/共63页第48页/共63页第49页/共6
12、3页第50页/共63页孢子或摇瓶菌丝一级种子罐二级发酵发酵罐二级种子罐三级发酵发酵罐四级发酵发酵罐三级种子罐种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数：1、接种量2、孢子发芽能力、菌体生长特性3、发酵规模级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级种子进入发酵罐：能迅速生长，达到一定的量，利于产物合成。第51页/共63页第52页/共63页种子制备过程举例种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵发酵第53页/共63页1、斜面、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1
13、%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超生长良好，所使用斜面连续传代不超过过 3次次第54页/共63页2.一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养
14、基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基第55页/共63页3.二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），），32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基第56页/共63页种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字
15、排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛第57页/共63页二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵第58页/共63页一、斜面孢子一、斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天,注意湿度注意湿度50%左右左右第59页/共63页二、大米孢子二、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大
16、米及氮源（玉米浆）培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢个孢子子第60页/共63页3、一级种子、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨4、二级种子、二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%第61页/共63页第62页/共63页感谢您的观看。感谢您的观看。第63页/共63页
