1、细胞工程动物细胞培养（优选）细胞工程动物细胞培养取材取材TrypsinEDTAcollagenase取材部位是否准确组织是否保持活性材料处理是否恰当2 原代培养原代培养组织块培养组织块培养组织块的培养3 传代培养传代培养消化法消化法一般传代培养的步骤一般传代培养的步骤(1)(1)吸出培养瓶内旧培养液。吸出培养瓶内旧培养液。(2)(2)加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混合液盖满瓶底。混合液盖满瓶底。(3)2(3)25 5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细分钟后检查，如有细胞间隙变大，细 胞质回缩现象，终止消化。胞质回缩现象，终止消化。(4)(4)吸出消化液，加入吸出消化液，加入PBSP
2、BS液，轻轻转动以液，轻轻转动以 免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单 用胰蛋白酶，可直接加入培养液。用胰蛋白酶，可直接加入培养液。(5)(5)用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬 液，计数后记录其浓度。液，计数后记录其浓度。（6 6）重新接种培养。）重新接种培养。（二）建立细胞系过程（二）建立细胞系过程肿瘤细胞的体外培养与建系过程肿瘤细胞的体外培养与建系过程以人上皮型食管癌以人上皮型食管癌109细胞系的建立为细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程例介绍一下具体的建系过程（1）取材）取材食管癌患者的手术标本食管癌患者的手术
3、标本（2）原代培养）原代培养1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于培养液内，于4下静置下静置2小小 时。时。2）然后将组织剪切成然后将组织剪切成12mm3的小块。用含的小块。用含 青霉素和链霉素的青霉素和链霉素的RPMI 1640培养培养液洗液洗 涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培玻璃培 养瓶中。养瓶中。3）于于37、CO2培养箱内培养培养箱内培养2小时后，再小时后，再 补加含补加含20%的小牛血清的的小牛血清的RPMI 1640培培 养液，继续培养。养液，继续培养。涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原
4、的玻璃培冻细胞名称和冷冻日期。1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。(3)25分钟后检查，如有细胞间隙变大，细二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。RPMI 1640培养液内，于4下静置2小二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培（五）动物细胞大规模培养活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中
5、的百分比表示细胞活力（1）细胞非洲绿猴肾细胞Vero细胞(ATCC):3 四唑盐（MTT）比色法细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细cool too fast formation of ice crystals inside the cell（3）建系过程）建系过程组织块在接种组织块在接种1 1周后，上皮细胞从组织块周围向周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。外迅速迁移和生长，相互连接成片。2 2周后，可周后，可以见到成纤维细胞生长。以见到成纤维细胞生长。8 8周后，上皮细胞生长周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。开始明显
6、加快，并向周围延伸。用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2 2周周后细胞形成群落。第后细胞形成群落。第4 4代后细胞开始呈单层生长，代后细胞开始呈单层生长，命名为命名为ECA109ECA109。ECA109 ECA109 经生物学特性分析后经生物学特性分析后确定细胞系建立成功确定细胞系建立成功建立细胞系的要求建立细胞系的要求国际上对Certified cell的确定尚无统一标准1 组织来源2 细胞
7、生物学检测形态，特异结构，细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特异性如腺细胞，肿瘤细胞3 培养条件和方法（三）细胞系和细胞株鉴定鉴定指标纯度，细胞学特性，稳定性，污染情况鉴定方法细胞形态学观察，绘制生长曲线，计算分裂指数，染色体组型和带型分析，同工酶酶谱检测档案资料及管理使用美国标准细胞库ATCC,人遗传突变细胞库HGMR,细胞衰老细胞库CAR细胞计数细胞计数四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左线和上线边的细胞。细胞密度个/ml平均细胞数x103x稀释倍数培养细胞活力测定培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。之一
8、。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。从形态上区别死、活细胞是困难的。1 1 细胞克隆形成率实验细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖单个细胞在体外增殖6 6代以上，其后代所组成的代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力细胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数克隆形成率比克隆形成数接种细胞数 缺点：操作繁琐缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠优点：精确、可靠2.台盼蓝法台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，活细胞不
9、被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力胞活力 )，50LCellCul(2)加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。38 水浴中，使其融化（1分钟左右）。cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。（五）动物细胞大规模培养TrypsinEDTA4 存活率可达80一90。原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原
10、成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。RPMI 1640培养液内，于4下静置2小每隔一定的时间去除部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变，并使细胞呈指数生长，可长时期进行生产，反复收获产品。后者是一重要技术，包括微载体、多空载体、微囊（4）生物反应器培养系统与工艺生物反应器培养非洲绿猴肾细胞vero和狂犬病毒养瓶中。灌流式操作把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又不断地灌注新地培养基。)，50LCellCul2）然后将组织剪切成12mm3的小块。TrypsinEDTA3
11、 四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法 四唑盐（四唑盐（MTTMTT）商品名为噻唑蓝，）商品名为噻唑蓝，原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（干水的蓝紫色产物（formazan)formazan)，并沉淀在细，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSODMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的溶液颜色深浅与所含的formazanformazan量成正比。再量成正比。再用酶标仪测定用酶标仪测定ODOD值值 MTTMTT法简单快
12、速准确，广泛应用于新药法简单快速准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。（1）单细胞悬液接种于）单细胞悬液接种于96孔孔培养板；培养板；103104 细胞细胞/孔，每孔孔，每孔培养基总量培养基总量200ul（96孔培养板每孔培养板每孔容积孔容积370ul），），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）目的决定培养时间）（2）加入）加入2mgml的的MTT液液（50ul孔）；继续培养孔）；继续培养3小时。小时。（3）吸出孔内培养液后，加）吸出孔内培养液后，加入入DMSO液（液（15
13、0ul孔），将培孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔）酶标仪检测各孔OD值值（检测波长（检测波长570nm），记录结果，），记录结果，绘制生长曲线。绘制生长曲线。操作步骤操作步骤:（四）细胞冻存和复苏（四）细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。减少细胞生物学特性变化。液氮罐CryopreservationHow does f
14、reezing induce damage?cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth Thawing rate is also important(thaw rapidly)最适度以下的最适度以上的慢冻程序慢冻程序标准程序标准程
15、序 当温度在当温度在25 25 以上时，以上时，1 12 2/min/min 当温度达当温度达25 25 以下时，以下时，5 510/min 10/min 当温度达当温度达100100时，可迅速放入液氮中细胞冻存时，可迅速放入液氮中细胞冻存器器简易程序简易程序 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1 12 2 的的速度，在速度，在4040分钟内降至液氮表面，停分钟内降至液氮表面，停3030分钟后，分钟后，直接投人液氮中。直接投人
16、液氮中。低温保护剂的应用低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。效果。常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSODMSO，它是一种渗透性保，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。（五）动物细胞大规模培养二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝
17、紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。胞质回缩现象，终止消化。（1106 5 106细胞/ml)连续式操作采用机械搅拌式生物反应器，将细胞接种到一定的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达到最大密度之前以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，培养体积恒定。一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等。Thawing rate is also important(thaw rapidly)1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，
18、溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。灌流式操作把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又不断地灌注新地培养基。（1）细胞非洲绿猴肾细胞Vero细胞(ATCC):机械搅拌式生物反应器，一次性将扩大的细胞和培养液投入，在培养过程中其体积不变，不添加其它成份，待细胞增长和产物积累到适当时间，一次性对细胞，产物和培养基进行收获。38 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）培养基DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium GIBCOL)
19、，5%10%小牛血清和硫酸庆大1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的养液，继续培养。（1106 5 106细胞/ml)问题一 细胞贴壁生长的载体以人上皮型食管癌109细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程（1）细胞非洲绿猴肾细胞Vero细胞(ATCC):细胞冻存方法细胞冻存方法1 1 预先配制冻存液预先配制冻存液 含含20%20%血清培养基血清培养基 10%DMSO 10%DMSO 2 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入 适量冻存液适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬用吸管吹打制成细胞悬液液 （1 1106 106 5 5 106106细胞细胞/ml)/m
20、l)3 3 加入加入1ml1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷细胞于冻存管中，密封后标记冷 冻细胞名称和冷冻日期。冻细胞名称和冷冻日期。4 4 存活率可达存活率可达8080一一9090。DMSODMSO液用培液用培 养液配好，避免因临时配制产热而伤养液配好，避免因临时配制产热而伤害害 细胞。细胞。细胞复苏方法细胞复苏方法（l l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3737 38 38 水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（1 1分钟左右）。分钟左右）。（2 2）5 5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的1010倍倍 以上。以上。（3 3）低速离心）低速离
21、心1010分钟。分钟。（4 4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细 胞。胞。1 基本流程基本流程分批式分批式batch，流加式流加式fedbatch，半连续式半连续式semicontinuous，连续式，连续式，灌流式灌流式perfusion（五）动物细胞大规模培养（五）动物细胞大规模培养2 生物反应器系统生物反应器系统（1）生物反应器）生物反应器设计依据除了以人工诱变为目的的培养外，用于除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长
22、环境。由于动物细胞生长的特殊性，长环境。由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。特殊载体的选择。（2）分类）分类一般有微载体式、中空纤维式、一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等型的反应器等。分批式操作早期采用的方式，是其它操作方式的基础。机械搅拌式生物反应器，一次性将扩大的细胞和培养液投入，在培养过程中其体积不变，不添加其它成份，待细胞增长和产物积累到适当时间，一次性对细胞，产物和培养基进行收获。流
23、加式操作主流优势。机械搅拌式生物反应器，悬浮培养细胞或以微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/31/2，在培养过程中，根据细胞对营养物质的不断消耗和需求及时补充新的营养成份，使细胞持续生长。细胞或产物达到所需指标后终止培养，一次性回收整个反应体系，分离纯化产品。半连续式操作又称为重复批式培养或换液培养，采用机械搅拌式生物反应器，悬浮培养形式。每隔一定的时间去除部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变，并使细胞呈指数生长，可长时期进行生产，反复收获产品。连续式操作采用机械搅拌式生物反应器，将细胞接种到一定的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达到
24、最大密度之前以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，培养体积恒定。灌流式操作把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又不断地灌注新地培养基。可采用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞和固定床或流化床生物反应器。细胞截留系统维持较高的细胞密度；连续灌流系统使细胞处于较好的营养环境，有害代谢物浓度降低；反应速率易控制；产品在罐内停留时间短，活性好。（3）动物细胞培养的载体动物细胞培养的载体实现规模化急需解决的问题实现规模化急需解决的问题 问题一问题一 细胞贴壁生长的载体细胞贴壁生长的载体微载体培养技术微
25、载体培养技术19671967年，年，Van WezelVan Wezel开发了微载体系统培开发了微载体系统培养贴壁细胞。养贴壁细胞。微载体是直径微载体是直径60250m60250m的微珠。多用带的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。的贴壁及生长。*贴壁培养的载体材料贴壁培养的载体材料 与生物反应器系统与生物反应器系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。体系统等。后者是一重要技术，包括微载体、多空后者是一重要技术，包括微载体、多空
26、载体、微囊载体、微囊*一种微载体产品及孔状的显微结构一种微载体产品及孔状的显微结构材料：生物相容性，机械稳定性热稳定性（4）生物反应器培养系统与工艺）生物反应器培养系统与工艺问题二问题二 系统构建系统构建问题三问题三 传代技术传代技术问题四问题四 培养工艺培养工艺与微载体结合的生物反应器系统与微载体结合的生物反应器系统（5）培养工艺）培养工艺连续灌注培养连续灌注培养新 鲜 培 养 液流 处 的 培 养 液悬 浮 的 微 载 体生 物 反 应 器一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等。（1106 5 106细胞/ml)机械搅拌式生物反应器，一次性将扩大的细胞和培养液
27、投入，在培养过程中其体积不变，不添加其它成份，待细胞增长和产物积累到适当时间，一次性对细胞，产物和培养基进行收获。cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration以人上皮型食管癌109细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程（1106 5 106细胞/ml)（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细How does freezing induce damage?1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培（1）单细胞悬液接种于96孔培养板
28、；（4）生物反应器培养系统与工艺四角大方格内细胞数平均，若压中线者，只计算压左线和上线边的细胞。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。（优选）细胞工程动物细胞培养一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。Thawing rate is also important(thaw rapidly)细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。生长在载体上的动物细胞生长在载体上的动物细胞收获细胞一个问题一个问题怎样实现接种传代培养？怎样实现接种传
29、代培养？球传球技术球传球技术（6）应用举例）应用举例生物反应器培养非洲绿猴肾细胞生物反应器培养非洲绿猴肾细胞vero和狂犬病毒和狂犬病毒1 材料与方法材料与方法（1 1）细胞非洲绿猴肾细胞）细胞非洲绿猴肾细胞VeroVero细胞细胞(ATCC):(ATCC):150180 150180代。代。（2 2）培养基）培养基DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium GIBCOL)GIBCOL)，5%5%10%10%小牛血清和硫酸庆大小牛血清和硫酸庆大 霉素，用碳酸氢钠或盐酸调至霉素，用碳酸氢钠或盐酸调
30、至pH7.2pH7.2。（3 3）微载体微载体CT3CT3微载体微载体（4 4）反应器）反应器5LCellGen5LCellGen细胞培养反应器细胞培养反应器 (NBS.CO.U.S.A.)(NBS.CO.U.S.A.)，50LCellCul50LCellCul 50A 50A细胞培养生物反应器细胞培养生物反应器2 培养过程培养过程以以CelliGen5LCelliGen5L细胞培养反应器作为种子罐培养，细胞培养反应器作为种子罐培养，当细胞生长到一定密度时，将细胞和新的微载当细胞生长到一定密度时，将细胞和新的微载体一起移入体一起移入CellCul50ACellCul50A细胞培养反应器中细胞培
31、养反应器中 。自。自动控制温度动控制温度37370.10.1、溶解氧为、溶解氧为50%50%空气饱和空气饱和度、转速为度、转速为202032rpm32rpm。细胞培养到一定密度后，接种狂犬病毒。第细胞培养到一定密度后，接种狂犬病毒。第2 2天天停止搅拌，抽出培养基，加病毒培养基继续培停止搅拌，抽出培养基，加病毒培养基继续培养。病毒培养条件为养。病毒培养条件为pH7.4pH7.4pH7.8pH7.8、溶解氧为、溶解氧为40%40%60%60%空气饱和度、温度为空气饱和度、温度为37.037.0。（五）动物细胞大规模培养（1106 5 106细胞/ml)生物反应器培养非洲绿猴肾细胞vero和狂犬病
32、毒细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。每隔一定的时间去除部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变，并使细胞呈指数生长，可长时期进行生产，反复收获产品。2 生物反应器系统（优选）细胞工程动物细胞培养Thawing rate is also important(thaw rapidly)，50LCellCul（3）低速离心10分钟。以人上皮型食管癌109细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程国际上对Certified cell的确定尚无统一标准由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。材料：
33、生物相容性，机械稳定性后者是一重要技术，包括微载体、多空载体、微囊灌流式操作把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又不断地灌注新地培养基。后者是一重要技术，包括微载体、多空载体、微囊免细胞流失，洗去残留的消化液。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细生长在载体上的动物细胞1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。2 细胞生物学检测形态，特异结构，细胞生长曲线，分裂指数，接种率，特异性如腺细胞，肿瘤细胞（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细(1)吸出培养瓶内旧培养液。以人上皮型食管癌109细胞系的建立为例介绍一下具体的建
34、系过程(3)25分钟后检查，如有细胞间隙变大，细涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培（三）细胞系和细胞株鉴定二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗当温度在25 以上时，12/min二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。材料：生物相容性，机械稳定性2 生物反应器系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。（1）生物反应器设计依据cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。加碱（碳酸氢钠）加糖（葡萄糖）灌注培养液微载体5L种子罐培养培养液50L生物反应器接种狂犬病毒出液口DMEM培养基胎牛血清其它成分锥形瓶逐级放大培养收获病毒
