1、细菌和病毒的遗传转化接合2（优选）细菌和病毒的遗传转化接合一、一、转化转化(transformation)n概念某些细菌概念某些细菌(或其他生物或其他生物)能通过其细胞膜摄取能通过其细胞膜摄取周围供体周围供体(donor)(donor)的染色体片段，并将此外源的染色体片段，并将此外源DNADNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。片段通过重组整合到自己染色体组的过程。n只有当整合的只有当整合的DNADNA片段产生新的表现型时，才能测片段产生新的表现型时，才能测知转化的发生。转化中接受供体遗传物质的称为知转化的发生。转化中接受供体遗传物质的称为受体受体(receptor)(receptor)。
2、P213(一)、细菌转化实验(二)、转化过程(三)、转化在遗传分析中的应用(一一)、细菌转化实验、细菌转化实验1.1.基础知识基础知识荚膜 菌落 毒性类型光滑型S 发达 光滑有I,II,III粗糙型R 无粗糙无I,IIn野生型肺炎双球菌的菌落野生型肺炎双球菌的菌落n一种突变型为粗糙型一种突变型为粗糙型 n两者根本差异在于荚膜形成；两者根本差异在于荚膜形成；n荚膜的主要成分是多糖，荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性；具特殊的抗原性；n不同抗原型是遗传的、稳不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不发生定的，一般情况下不发生互变。互变。2.Griffith2.Griffith转化研究转化研究P21
3、3Griffith对其试验结论及发展对其试验结论及发展n根据上述研究结果Griffith认为n(有毒)死细菌中的某种物质转移到(无毒)活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡。n他将这种细菌遗传类型的转变称为转化，并将引起转化的物质称为转化因子(tranforming principle)。n以后一些研究者重复上述试验，并且加入了体外培养试验，即将加热杀死的SIII细菌与无毒RII细菌混合培养，然后注入小家鼠体内，同样导致家鼠死亡。表明n细菌在培养条件下也能够实现遗传类型间的定向转化。3.3.阿维利阿维利(Avery)(Avery)等的转化实验等的转化实验(1944)(1944)实验结果：来源
4、于加热杀死的SIII细菌，并使 RII细菌转化成为SIII型细菌的转化因子是DNA。实验结论n 转化定义某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的DNA而使它的基因型和表现型发生变化的现象称为转化。n Avery等人的实验也表明决定细菌遗传类型的物质是DNA，即证明了DNA就是遗传物质。（p36）n 由于他们采用的实验方法当时不被人们广泛接受，而且得出的结论与当时人们的传统观念(认为蛋白质是遗传物质)不符合，而长期没有得到人们的承认。P213细菌转化过程细菌转化过程v（一）转化的过程（一）转化的过程 非感受态细胞非感受态细胞 外源外源DNA被洗掉了被洗掉了转化因子转化因子 感受态细胞感受
5、态细胞 外源外源DNA仍与细胞结合仍与细胞结合 整合整合 吸收吸收吸附洗涤两种核酸酶：两种核酸酶：切为约切为约14kb14kb的片段的片段使外源使外源DNADNA片段变为单链片段变为单链(二二)、转化过程、转化过程P214(二二)、转化过程、转化过程1.感受态与感受态因子感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用Ca2+(CaCl2)处理对数生长后期的
6、大肠杆菌可以增强其感受能力。P214转化过程2.供体DNA与受体细胞结合(binding)结合发生在受体细胞特定部位；供体DNA片段为双链；结合过程是一个可逆过程。3.DNA的穿入和摄取当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源DNA；往往只有一条DNA单链进入细胞，另一条链在膜上降解。4.联会(synapsis)与外源DNA片段整合(integration)整合指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，稳定掺入到受体DNA中的过程，实际就是遗传重组的过程。研究整合的分子机制也就是研究遗传重组的分子机制。P214转化过程转化过程P213(三三)、转化在遗传分析中的应用n共转化供体一条DNA片段
7、上的两个基因同时转化的现象称为。共转化与遗传图谱绘制共转化与遗传图谱绘制n利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离成正向关系基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。因此可能通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。转化因子 感受态细胞 外源DNA仍与细胞结合研究整合的分子机制也就是研究遗传重组的分子机制。B苏氨酸缺陷型thr和亮氨酸缺陷型leu。中断杂交试验及重组作图。一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用Ca2+(CaCl2)处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。戴维
8、斯(Dawis 1950)U型管试验；将A、B品系混合接种在基本培养基表面；理解细菌和病毒在遗传研究中的优越性和意义；重组体未减少 基本培养基具有F因子的菌株可作为供体，F因子中有控制F性伞毛(F pillus)形成的基因。F因子及其在杂交中的行为his2 +-+-+仅有一部分F因子（近原点处）被转移；平板上长出原养型菌落(+)。实验结果：来源于加热杀死的SIII细菌，并使 RII细菌转化成为SIII型细菌的转化因子是DNA。中断杂交试验及重组作图。大肠杆菌存在两种类型品系：雌性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的供体与受体。仅有一部分F因子（近原点处）被转移；重组体未减少 基本培养基细菌为单倍
9、配子体生物，异核体和二倍体只能暂存。转化与遗传图谱转化与遗传图谱v应用：应用：两个基因同时转化的效率（连锁或不连锁）两个基因同时转化的效率（连锁或不连锁）基因定位（遗传作图）（枯草杆菌）基因定位（遗传作图）（枯草杆菌）P215v杂交实验：杂交实验：trp2+his2+tyr1+trp2-his2-tyr1-（黎德伯格等）（黎德伯格等）v结果结果(转化子类型转化子类型):基因座位基因座位 trp2 +-+his2 +-+-+tyr1 +-+-数目数目 11940 3660 685 418 2600 107 1180 3660p215 trp2 34 his2 13 tyr1表表10-518二、接
10、合二、接合(conjugation)(一)、接合现象的发现和证实(二)、F因子及其在杂交中的行为(三)、中断杂交试验作图概念：在原核生物中，接合是指遗传物质从供体“雄性”转移到受体“雌性”的过程。P215重点：接合的概念与基本原理、掌握重点：接合的概念与基本原理、掌握F F-、F F+、HfrHfr菌株的概念、区别和用途；中断杂交试验及重组菌株的概念、区别和用途；中断杂交试验及重组作图。作图。(一一)、接合现象的发现和证实、接合现象的发现和证实材料大肠杆菌材料大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株的两菌株的两个营养缺陷型品系个营养缺陷型品系 A甲硫氨酸缺陷型甲硫氨酸缺陷型met
11、和生物素缺陷型和生物素缺陷型bio；B苏氨酸缺陷型苏氨酸缺陷型thr和亮氨酸缺陷型和亮氨酸缺陷型leu。方法方法 将将A、B两菌株混和，在基本培养基两菌株混和，在基本培养基(固体固体)上上涂布培养。涂布培养。结果结果 平板上长出原养型菌落平板上长出原养型菌落(+)。P21519461946年，年，黎德伯格和塔特姆的大肠杆菌杂交试验：黎德伯格和塔特姆的大肠杆菌杂交试验：1946年年 黎德伯格和塔特姆接合试验黎德伯格和塔特姆接合试验原养型菌落频率原养型菌落频率10-7几种可能解释及其分析几种可能解释及其分析n 对上述试验结果原养型菌落可能产生于n 亲本细菌A或B发生了回复突变；n 两品系细胞通过培
12、养基交换养料互养作用；n 两品系间交换DNA；n 发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。P216n 结论：这些解释均不成立。回复突变？回复突变？nLederbery和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。n单基因回复突变的频率约为106；n双基因回复突变的频率则为1012，频率很低。n但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基本可以排除回复突变的可能。互养作用？互养作用？n 试验材料：A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。n 试验方法：将
13、A、B品系混合接种在基本培养基表面；短时间后喷T1杀死A品系，使其不能持续产生thr与leu供B品系持续生长。n 结果与结论：仍然出现原养型菌落。从而表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。交换交换DNA？nLederberg和Tatum曾把品系A的培养液经加热灭菌，加入到B品系的培养物中，未得到原养型菌落；表明原养型菌落可能不是由转化作用产生。n戴维斯(Dawis 1950)U型管试验；n实验结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件。结果没有得到原养型细菌；异核体和杂合二倍体？异核体和杂合二倍体？若细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这两种情况类似于二倍体生物的杂
14、合体,将产生原养型菌落。异核体指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成 不同的两个或多个细胞核。双杂合二倍体是指异核体进一步发生核融合，形 成二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存。培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落，对试验中得到的原养型菌落后代研究表明，后代没有出现预期的性状分离现象。接合现象的发现和证实接合现象的发现和证实n 经过上述分析可认为经过上述分析可认为n 在在Lederberg和和Tatum的试验中，发生了一种不同于的试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为接合。转化的遗传重组方式，称之为接合。n Hayes(1952)
15、研究表明研究表明n 大肠杆菌两种不同菌株大肠杆菌两种不同菌株(品系品系)接合过程中遗传物质的转接合过程中遗传物质的转移是单向的；移是单向的；P217大肠杆菌存在两种类型品系：雌性与雄性分别作为接大肠杆菌存在两种类型品系：雌性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的供体与受体。合过程中遗传物质的供体与受体。n 接合接合(conjugation)：遗传物质从供体转移到受体的重组过程。遗传物质从供体转移到受体的重组过程。1.F因子：n Hayes等深入研究发现，大肠杆菌在接合中作供体的能力受细胞内一种致育因子（F因子-fertility factor；性因子-sex factor）控制。(二二)、F F因
16、子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为P217n F因子的化学本质是DNA，可以自主状态存在于胞质中或整合到细菌的染色体上，又称F质粒。(二二)、F F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为P217n F因子可以在细菌细胞间进行转移并传递遗传物质。图10-14nF因子结构：原点（origin）致育基因（fertility gene）配对区（pairing region）大肠杆菌存在两种类型品系：雌性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的供体与受体。利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：二、接合(conjugation)1946年 黎德伯格和塔特姆接合试验中断杂交试验及重组作图。单链
17、断裂单链DNA从供体向受体转移高频重组：细菌重组子频率为104。相反的重组子不出现，所以在选择性培养基上只出现一种重组子。F细菌可以把F因子传给后代。(三)、转化在遗传分析中的应用亲本细菌A或B发生了回复突变；将A、B品系混合接种在基本培养基表面；平板上长出原养型菌落(+)。重组体未减少 基本培养基(一)、接合现象的发现和证实F细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后不再出现。两品系细胞通过培养基交换养料互养作用；由于他们采用的实验方法当时不被人们广泛接受，而且得出的结论与当时人们的传统观念(认为蛋白质是遗传物质)不符合，而长期没有得到人们的承认。Lederberg和Tatum曾把品系A的培养液经加
18、热灭菌，加入到B品系的培养物中，未得到原养型菌落；F因子及其在杂交中的行为结合发生在受体细胞特定部位；Hfr菌株重组频率比 F+高500多倍图图10-15 大肠杆菌大肠杆菌F因子的三种状态因子的三种状态供体菌供体菌(雄性雄性)受体菌受体菌(雌性雌性)高频重组菌株高频重组菌株具有F因子的菌株可作为供体，F因子中有控制F性伞毛(F pillus)形成的基因。F性伞毛是由供体细胞表面伸出的一种长附属物，与受体细胞接合，就成为两个细胞之间原生质的通道，叫接合管(conjugation tube)。接合现象接合现象P217图图10-1610-16F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为F因子在宿主
19、染色体上有许多特定的插入位点和方向，整合频率为每代10-510-7。性伞毛形成结合桥/管，产生核酸内切酶，该酶在oriT转移起始点处一条单链上切开一个口，供体DNA从5末端开始向受体转移。P218-220接合过程：F 和 F 的杂交细菌间接触接合管形成单链断裂单链DNA从供体向受体转移环化环化（F+F-）或DNA双链的形成（部分二倍体）（Hfr Hfr F F-）重组交换（奇偶次交换）。接合过程：F 和 F 的杂交F因子的特点 F细菌可以把F因子传给后代。F细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后不再出现。F可以和F杂交，而不能和F杂交。F和F杂交后代皆为F，而且可以以107频率获得重组体后代。Hf
20、r 和 F 杂交v 仅有一部分F因子（近原点处）被转移；v 受体获得完整的F因子-这种情况频率非常低。v 高频重组：细菌重组子频率为104。P219接合过程：Hfr 和 F 杂交v细菌重组特点：细菌重组特点：只有偶数次交换才能产生平衡的重组子。相反的重组子不出现，所以在选择性培养基上只出现一种重组子。部分二倍体部分二倍体/部分合子部分合子图图10-1810-18细菌部分二倍体的形成及单交换和双交换的结果细菌部分二倍体的形成及单交换和双交换的结果知识要点：p219 奇偶次交换(三三)、中断杂交试验作图、中断杂交试验作图n 雅各布(Jacob，F)和沃尔曼(Wollman，E.)著名的中断杂交试验
21、(interrupted mating experiment)。n 试验材料n Hfr:thr+leu+aziS tonS lac+gal+strsn F:thr leu aziR tonR lac gal strRP231n thrthr、leuleu、laclac、galgal分别代表苏氨酸、亮氨酸、乳糖分别代表苏氨酸、亮氨酸、乳糖和半乳糖，和半乳糖，+代表原养型或发酵型，代表原养型或发酵型，代表营养缺陷型代表营养缺陷型或不发酵型；或不发酵型；aziazi和和tonAtonA分别代表叠氮化纳和分别代表叠氮化纳和T T1 1噬菌体；噬菌体；StrStr表示链霉素，表示链霉素，r r代表抗性，
22、代表抗性，s s代表敏感。代表敏感。A甲硫氨酸缺陷型met和生物素缺陷型bio；结果没有得到原养型细菌；发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。了解温和性噬菌体、烈性噬菌体的生活周期；细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存。利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：整合 吸收亲本细菌A或B发生了回复突变；从而表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。单链断裂单链DNA从供体向受体转移coli K12菌株A、B的实验（1952）将A、B品系混合接种在基本培养基表面；研究整合的分子机制也就是研究遗传重组的分子机制。F因子及其在杂交中的行为高频重组：细菌重组子频率为104。单链
23、断裂单链DNA从供体向受体转移完全培养基培养一段时间 洗涤离心实验结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件。v 理解细菌和病毒在遗传研究中的优越性和意义；v 掌握转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；v 掌握F-菌株、F+菌株、Hfr菌株的概念、区别和用途；v 区别F因子、F因子的异同；v 了解温和性噬菌体、烈性噬菌体的生活周期；v 掌握原噬菌体、溶源性细菌的概念；v 了解细菌和病毒遗传作图的原理和基本过程。本章要求 W.Hayes关于E.coli K12菌株A、B的实验（1952）链霉素处理A菌 完全培养基培养一段时间 洗涤离心 B菌 重组体未减少 基本培养基链霉素处理B菌 完全培养基培养一段时间 洗涤离心 A菌 无重组体产生 基本培养基 结论：细菌接合过程中遗传物质的转移是单向的，即遗传物质从A株转移到了B株。阻碍细菌阻碍细菌分裂，分裂，并不杀死并不杀死细菌细菌
