1、Enzyme EngineeringEnzyme Engineering什么是酶分子修饰酶分子修饰（酶分子修饰（enzyme molecular modification）通过各种方法使酶分子的通过各种方法使酶分子的发生某些改变，从而改变酶的发生某些改变，从而改变酶的的技术过程的技术过程酶分子工程（酶分子工程（enzyme molecular engineering）指按照酶的各种特性的需要，依据指按照酶的各种特性的需要，依据，在分，在分子水平上实现酶的结构设计和操作子水平上实现酶的结构设计和操作分子生物学水平：用基因工程方法对分子生物学水平：用基因工程方法对 DNA 或或 RNA 进行分子改
2、进行分子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白造，以获得化学结构更合理的酶蛋白一级结构水平：对天然的酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨一级结构水平：对天然的酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等?Enzyme EngineeringEnzyme Engineering对酶进行分子修饰的原因和依据在非生理条件下，酶的某些性质不满足工程应用在非生理条件下，酶的某些性质不满足工程应用生理最适温度、生理最适温度、pH 值值 体外最适温度、体外最适温度、pH 值值酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较差酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较
3、差酶在非生理条件下活力下降，抗原性显著酶在非生理条件下活力下降，抗原性显著理论依据和方法理论依据和方法酶的结构特点与酶催化特性的关系：酶的结构特点与酶催化特性的关系：理性设计（理性设计（rational design）：找出关键结构，在掌握酶的）：找出关键结构，在掌握酶的的基础上，有目的地对其进行改造的基础上，有目的地对其进行改造半理性设计（半理性设计（semi-rational design）：以基因的）：以基因的为手为手段，参考酶的构效关系进行关键位点的改造段，参考酶的构效关系进行关键位点的改造Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶分子修饰的意义：我们究
4、竟要做什么？应用角度应用角度 酶工程酶工程提高酶的催化提高酶的催化，改变底物，改变底物增强酶的增强酶的，降低，降低/消除酶的消除酶的研究角度研究角度 酶学酶学研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探索酶的结构与催化特性之间的关系索酶的结构与催化特性之间的关系探测酶活性必需氨基酸的性质和数目探测酶活性必需氨基酸的性质和数目探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动探索酶的作用机理和催化反应历程探索
5、酶的作用机理和催化反应历程Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维持酶活性功能的必需基团持酶活性功能的必需基团pH 值与离子强度值与离子强度决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态修饰反应的温度与时间修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应反应体系中酶与修饰剂的比例反应体系中酶与修饰剂的比例控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的
6、活性完全丧失控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的活性完全丧失Enzyme EngineeringEnzyme Engineering影影响响酶酶蛋蛋白白化化学学修修饰饰反反应应进进程程的的因因素素酶酶蛋蛋白白功功能能基基团团反反应应性性修修饰饰剂剂的的反反应应性性功功能能基基团团pKa值值微微区区极极性性氢氢键键效效应应静静电电效效应应位位阻阻效效应应选选择择性性吸吸附附静静电电相相互互作作用用位位阻阻效效应应催催化化因因素素局局部部环环境境极极性性Enzyme EngineeringEnzyme Engineering化学修饰的方法学修修饰饰程程度度和和修修饰饰部部位位的的测测定定化化学
7、学修修饰饰数数据据分分析析分分析析方方法法直直接接法法 光光谱谱法法追追踪踪检检查查间间接接法法 修修饰饰后后水水解解测测定定化化学学修修饰饰时时间间进进程程分分析析确确定定必必需需基基团团的的性性质质和和数数目目 比比较较一一级级反反应应动动力力学学常常数数（Ray,1961）统统计计学学方方法法（邹邹承承鲁鲁,1962）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering化学修饰的方法学化化学学修修饰饰结结果果蛋蛋白白酶酶功功能能改改变变修修饰饰残残基基的的稳稳定定性性未未被被发发现现的的修修饰饰修修饰饰发发生生在在活活性性部部位位或或必必需需基基团团上上 蛋蛋白白质质
8、活活性性的的丧丧失失与与修修饰饰程程度度呈呈化化学学计计量量关关系系修修饰饰是是否否可可逆逆 当当修修饰饰基基团团去去除除后后酶酶是是否否恢恢复复活活力力是是否否修修饰饰远远离离活活性性部部位位的的氨氨基基酸酸原原始始修修饰饰后后，修修饰饰残残基基是是否否发发生生共共价价改改变变 基基团团转转移移（酰酰基基、巯巯基基、卤卤素素）基基团团降降解解或或氧氧化化（碘碘化化物物脱脱碘碘等等）修修饰饰产产物物不不稳稳定定，在在纯纯化化时时被被水水解解某某些些修修饰饰反反应应不不易易检检测测 Hg 修修饰饰巯巯基基的的同同时时能能裂裂解解二二硫硫键键 色色氨氨酸酸形形成成配配合合物物，但但光光谱谱被被酪酪
9、氨氨酸酸光光谱谱掩掩盖盖Enzyme EngineeringEnzyme Engineering酶分子修饰的种类金属离子置换修饰金属离子置换修饰（）大分子结合修饰大分子结合修饰（）侧链基团修饰侧链基团修饰（）亲和修饰亲和修饰肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰（）核苷酸链有限水解修饰核苷酸链有限水解修饰氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰核苷酸置换修饰核苷酸置换修饰酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰酶的定向进化修饰酶的定向进化修饰Enzyme EngineeringEnzyme Engineering金属离子置换修饰Metal ion substitute modification把酶分子中的金属离子换成另
10、一种金属离子，使酶的催化特性把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法发生改变的修饰方法通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制机制适用对象：适用对象：（metalloenzyme）一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为 金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用稳定作用金属酶纯化时仍保留着金属酶纯化时仍保留着的功能金属离子的功能金属离子Enzyme Engineerin
11、gEnzyme Engineering金属离子置换修饰常见的金属酶及其离子种类常见的金属酶及其离子种类-淀粉酶淀粉酶 Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 Zn2+过氧化氢酶过氧化氢酶 Fe2+酰基氨基酸酶酰基氨基酸酶 Zn2+超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 Cu2+、Zn2+细胞色素细胞色素 P450 单加氧酶单加氧酶 Fe2+固氮酶固氮酶 Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶 Se(IV)主要的金属离子主要的金属离子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等等Cyt P450Enzyme EngineeringEnzyme Engineering金
12、属离子置换修饰金属离子置换修饰的方法金属离子置换修饰的方法酶的提纯酶的提纯除去原有金属离子除去原有金属离子加入加入，如，如 EDTA 等，让酶分子中的金属离子与等，让酶分子中的金属离子与 EDTA形成螯合物形成螯合物透析、超滤或层析除去螯合物透析、超滤或层析除去螯合物加入置换的离子加入置换的离子加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合用透析或层析等方法除去未结合的离子用透析或层析等方法除去未结合的离子Enzyme EngineeringEnzyme Engineering金属离子置换修饰金属离子置换修饰的作用金属离子置换修饰的作用阐明金属离子对酶催化
13、作用的影响阐明金属离子对酶催化作用的影响一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶/辅基可逆结合，从辅基可逆结合，从而起到催化作用而起到催化作用提高酶的催化效率提高酶的催化效率将将 Zn 型型-淀粉酶置换成淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高型，活力可提高 20%30%增强酶的稳定性增强酶的稳定性Fe-SOD 置换成置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降低敏感性降低改变酶的动力学特性改变酶的动力学特性酰化氨基酸水解酶活性部位的酰化氨基酸水解酶活性部位的 Zn 被被 Co 置换后，酶的底物专一性置换后，酶的底物专一性（Km 值）
14、和最适值）和最适 pH 都显著改变都显著改变Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰Macromolecules combine modification采用水溶性大分子与酶的侧链基团采用水溶性大分子与酶的侧链基团，使酶分子的空，使酶分子的空间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法常用的大分子常用的大分子糖、糖的衍生物糖、糖的衍生物聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）含含 C=C 双键单体聚合得到的聚合物双键单体聚合得到的聚合物多肽链，甚至蛋白质多肽链，甚至蛋白质Enzyme Engineerin
15、gEnzyme Engineering大分子结合修饰大分子结合修饰的方法大分子结合修饰的方法选择修饰剂选择修饰剂选择溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、无毒的大分子选择溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、无毒的大分子聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、寡聚糖、多糖及其衍生物等）、寡聚糖、多糖及其衍生物等修饰剂的活化修饰剂的活化将修饰剂分子中的基团（将修饰剂分子中的基团（OH）转化为高反应性的基团）转化为高反应性的基团修饰反应修饰反应将活化过的修饰剂与纯化的酶液按照一定比例混合反应，控制温将活化过的修饰剂与纯化的酶液按照一定比例混合反应，控制温度、度、pH 等条件等条件分离分离层析分离，除去多余的修饰剂层
16、析分离，除去多余的修饰剂Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 PEG 既可溶于水，又可溶于多种有机溶剂既可溶于水，又可溶于多种有机溶剂微毒或无毒微毒或无毒免疫原性低免疫原性低生物相容性好，已通过生物相容性好，已通过 FDA 认证认证分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大末端有两个能被活化的末端有两个能被活化的 OH 基团基团为了获得单功能的为了获得单功能的PEG，将其中一个羟基转化为烷氧基，即，将其中一个羟基转化为烷氧基，即Enzyme EngineeringEnzyme Enginee
17、ring大分子结合修饰修饰剂修饰剂 MPEGEnzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 MPEG叠氮法：将叠氮法：将OH转化为转化为N3 基团基团Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 MPEG琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 MPEG重氮法：将重氮法：将OH转化为转化为N=N 基团基团Enzyme EngineeringEnzyme Engineer
18、ing大分子结合修饰修饰剂修饰剂 右旋糖酐（右旋糖酐（dextran）右旋糖酐是由葡萄糖通过右旋糖酐是由葡萄糖通过 形成的高分子多糖形成的高分子多糖水溶性较好水溶性较好生物相容性好生物相容性好糖链上的糖链上的 经活化后可与酶分子中的氨基结合经活化后可与酶分子中的氨基结合Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 右旋糖酐右旋糖酐溴化氰（溴化氰（CNBr）法：糖酐活化）法：糖酐活化Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 右旋糖酐右旋糖酐溴化氰（溴化氰（CNBr）法：与酶偶联）法：与
19、酶偶联Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 右旋糖酐右旋糖酐Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 右旋糖酐右旋糖酐高碘酸（高碘酸（HIO4）氧化法：增加连接臂）氧化法：增加连接臂Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 肝素（肝素（heparin）由由 D-葡萄糖醛酸（或葡萄糖醛酸（或 L-艾杜糖醛酸）和艾杜糖醛酸）和 N-乙酰氨基葡萄乙酰氨基葡萄糖形成重复二糖单位组成的多糖糖形成重复二糖单位组成的多糖在体内外都有
20、抗凝血作用在体内外都有抗凝血作用临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等脏导管检查、体外循环、血液透析等Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 肝素肝素碳二亚胺法（碳二亚胺法（COOH 反应）反应）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰修饰剂修饰剂 肝素肝素三氯均三嗪法三氯均三嗪法Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰大分子修饰的作用大分子修
21、饰的作用 提高酶的催化效率提高酶的催化效率根本原因：改变了酶的根本原因：改变了酶的，有可能促使酶活性中心与，有可能促使酶活性中心与底物更容易结合底物更容易结合酶的催化功能是由其空间结构决定的酶的催化功能是由其空间结构决定的例例1：1 分子核糖核酸酶与分子核糖核酸酶与 6.5 分子右旋糖酐共价结合，活力提高到原分子右旋糖酐共价结合，活力提高到原有的有的 2.25 倍倍例例2：1 分子胰凝乳蛋白酶与分子胰凝乳蛋白酶与 11 分子右旋糖酐共价结合，酶的催化效分子右旋糖酐共价结合，酶的催化效率提高到原酶的率提高到原酶的 5.1 倍倍Enzyme EngineeringEnzyme Engineerin
22、g大分子结合修饰大分子修饰的作用大分子修饰的作用 增强酶的稳定性增强酶的稳定性水溶性大分子与酶结合，在酶分子外层形成水溶性大分子与酶结合，在酶分子外层形成，可以保护，可以保护酶的空间构象酶的空间构象不溶性大分子与酶结合，形成不溶性大分子与酶结合，形成酶，也提高酶的稳定性酶，也提高酶的稳定性稳定性的表征稳定性的表征 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering大分子结合修饰大分子修饰的作用大分子修饰的作用 酶非经口（如注射）进入人体后，会成为一种抗原，刺激体内酶非经口（如注射）进入人体后，会成为一种抗原，刺激体内产生抗体；当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原产
23、生抗体；当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去催化功能的酶特异地结合，使酶失去催化功能经过大分子修饰，经过大分子修饰，从而降低了酶蛋白与体内抗体，从而降低了酶蛋白与体内抗体的结合几率的结合几率例如：例如：L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶 EC 3.5.1.1 经经 PEG 修饰后抗原性显著降低，修饰后抗原性显著降低，已经在已经在 1994 年被年被 FDA 批准用于治疗急性淋巴性白血病批准用于治疗急性淋巴性白血病Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰Side residues modification采用一定的（化学）方法，使
24、酶蛋白采用一定的（化学）方法，使酶蛋白，从，从而改变酶催化特性的修饰方法而改变酶催化特性的修饰方法用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响功能的影响荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力束缚能力利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中
25、的数量改变酶的结构和催化性能改变酶的结构和催化性能Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰两类酶的修饰两类酶的修饰蛋白类酶蛋白类酶侧链基团可组成各种次级键对蛋白质空间结构的形成和稳定起重侧链基团可组成各种次级键对蛋白质空间结构的形成和稳定起重要作用，而当这些功能基团发生改变，引起要作用，而当这些功能基团发生改变，引起，使空间，使空间结构发生某些变化，从而引起酶特性和功能的改变结构发生某些变化，从而引起酶特性和功能的改变侧链基团：侧链基团：亲核性取代的氨基酸残基亲核性取代的氨基酸残基:Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His 等等亲电性侧链基团：
26、芳香环、吲哚环亲电性侧链基团：芳香环、吲哚环亲电性取代的氨基酸残基亲电性取代的氨基酸残基:Tyr、Trp核酸类酶核酸类酶磷酸基，核糖糖环上的磷酸基，核糖糖环上的OH、碱基杂环及其、碱基杂环及其NH2、OH等等Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰几种重要的修饰反应几种重要的修饰反应烷基化烷基化多种基团均可发生，包括芳环和杂环多种基团均可发生，包括芳环和杂环氧化和还原氧化和还原酚基、酚基、SH、杂环等、杂环等芳香环取代芳香环取代涉及涉及 Phe、Tyr、Trp 等几种芳香族氨基酸等几种芳香族氨基酸其他反应，如其他反应，如 CNBr 裂解反应裂解反应E
27、nzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰各类侧链基团的修饰各类侧链基团的修饰胍基修饰（胍基修饰（Arg）羟基修饰（羟基修饰（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修饰（咪唑基修饰（His）吲哚基修饰（吲哚基修饰（Trp）甲硫基修饰（甲硫基修饰（Met）分子内交联分子内交联Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰1.修饰的主要特点修饰的主要特点氨基在酶蛋白中主要是氨基在酶蛋白中主要是 和肽链末端氨基和肽链末端氨基的的 -NH2 亲核反应活性很高，易被选择性修饰亲核反应活性很高，易被选择性修饰一般情况下一般情况下 -NH
28、2 的的 pKa=10，其解离程度取决于微环境，其解离程度取决于微环境氨基的修饰反应主要有酯化、氨基的修饰反应主要有酯化、N-烷基化等烷基化等Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰2.修饰的主要特点修饰的主要特点羧基在酶蛋白中主要是羧基在酶蛋白中主
29、要是，以及肽，以及肽链的末端羧基链的末端羧基在水溶液中，在水溶液中，COOH 通常解离成通常解离成，亲核性降低，对其，亲核性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、成酰胺反应修饰的方法有限，主要反应为成酯、成酰胺反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 羧基羧基酯化反应酯化反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰3.修饰的主要特点修饰的主要特点巯基在酶蛋白中的来源是巯基在酶蛋白中的
30、来源是 巯基的巯基的，往往是酶分子中反应活性最高的基团，往往是酶分子中反应活性最高的基团巯基容易被氧化成巯基容易被氧化成，在维持蛋白亚基之间的相互作用，在维持蛋白亚基之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用和酶催化过程中起重要作用巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产物巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产物Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链
31、基团修饰修饰反应修饰反应 Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰4.胍基（胍基（N=C(NH2)2）修饰的主要特点）修饰的主要特点胍基存在于酶蛋白的胍基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具有两个邻位胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具有两个邻位羰基的化合物，在中性或弱碱性条件下反应，一般是可逆反应羰基的化合物，在中性或弱碱性条件下反应，一般是可逆反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineer
32、ing侧链基团修饰修饰反应修饰反应 胍基胍基（与邻二酮的反应）（与邻二酮的反应）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰5.酚基和羟基（酚基和羟基（OH）修饰的主要特点）修饰的主要特点酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、Tyr羟基的羟基的，通常修饰剂能同时修饰羟基、氨基，通常修饰剂能同时修饰羟基、氨基和巯基和巯基相比于相比于 Ser 和和 Thr 的羟基要活泼一些，更容易发的羟基要活泼一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电取代反应生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电取代反应Enzyme Engineer
33、ingEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 酚基和酚羟基酚基和酚羟基酚基亲电取代反应酚基亲电取代反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 （酚）羟基（酚）羟基O-酰基化反应酰基化反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰6.咪唑基修饰的主要特点咪唑基修饰的主要特点咪唑基存在于酶蛋白的咪唑基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上对对 His 咪唑基的修饰，一般是通过咪唑基的修饰，一般是通过 N-烷基化或烷基化或 C-亲核取代来亲核取代来进行进行对咪唑进行修饰后，酶活性一
34、般会受到显著影响对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显著影响Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 咪唑基咪唑基N-取代反应取代反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 咪唑基咪唑基杂环上的亲电取代反应杂环上的亲电取代反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰7.吲哚基修饰的主要特点吲哚基修饰的主要特点吲哚基存在于酶蛋白的吲哚基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上Trp 残基疏水性较强，一般位于酶分子的内部，反应活性比氨残基疏水性较强
35、，一般位于酶分子的内部，反应活性比氨基和巯基差，因此对其修饰较困难很多能与吲哚基反应的试剂，基和巯基差，因此对其修饰较困难很多能与吲哚基反应的试剂，一般优先与巯基或氨基反应一般优先与巯基或氨基反应有时候有时候 Tyr 会对吲哚基的修饰产生干扰会对吲哚基的修饰产生干扰Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 吲哚基吲哚基与与 Koshland 试剂的反应试剂的反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰8.甲硫基修饰的主要特点甲硫基修饰的主要特点酶蛋白中酶蛋白中 中的硫以硫醚的形式存在中的硫以
36、硫醚的形式存在硫醚中的硫原子虽然具有亲核性，但反应活性较差，在温和的硫醚中的硫原子虽然具有亲核性，但反应活性较差，在温和的条件下一般不发生反应条件下一般不发生反应硫醚的主要反应主要是氧化反应，产物为砜和亚砜；另外，采硫醚的主要反应主要是氧化反应，产物为砜和亚砜；另外，采用某些试剂也可以进行用某些试剂也可以进行 S-烷基化反应烷基化反应Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰修饰反应修饰反应 甲硫基甲硫基Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰9.采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中对采用双功能基团
37、化合物（双功能试剂），在酶分子中对的两个氨基酸残基侧链基团之间进行共价交联的两个氨基酸残基侧链基团之间进行共价交联Enzyme EngineeringEnzyme Engineering侧链基团修饰分子内交联试剂分子内交联试剂同型、异型同型、异型可裂解、不可裂解可裂解、不可裂解Enzyme EngineeringEnzyme Engineering亲和修饰Affinity modification，酶的专一性修饰，酶的专一性修饰试剂作用于试剂作用于的某一基团，而不与这一部位之外的的某一基团，而不与这一部位之外的基团反应基团反应用于酶化学修饰的试剂，即使对某一基团反应是专一的，也仍用于酶化学修饰
38、的试剂，即使对某一基团反应是专一的，也仍然有多个同类残基与之反应，因此对某个特定残基的选择性修然有多个同类残基与之反应，因此对某个特定残基的选择性修饰比较困难，为了解决此问题，开发了亲和标记试剂饰比较困难，为了解决此问题，开发了亲和标记试剂这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有，可专一性标记于酶的，可专一性标记于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也称活性中心上，使酶不可逆失活，因此也称Enzyme EngineeringEnzyme Engineering亲和修饰Enzyme EngineeringEnzyme Engineering亲和修饰亲和
39、标记试剂的特点亲和标记试剂的特点在使酶不可逆失活以前，要与酶形成在使酶不可逆失活以前，要与酶形成亲和试剂的修饰程度是有限的亲和试剂的修饰程度是有限的竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率亲和试剂体积不能太大，否则造成较大的空间位阻亲和试剂体积不能太大，否则造成较大的空间位阻修饰产物应当稳定，应便于表征和定量修饰产物应当稳定，应便于表征和定量Enzyme EngineeringEnzyme Engineering亲和修饰KS 型（竞争性标记试剂）型（竞争性标记试剂）根据底物的结构设计的，具有与底物根据底物的结构设计的，具有与底物的结合基团，同的结合基团，同时还具
40、有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团时还具有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团特点特点底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物对修饰具有保护作用底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物对修饰具有保护作用修饰反应是定量定点进行的修饰反应是定量定点进行的Kcat 型（自杀性标记试剂）型（自杀性标记试剂）根据酶催化过程设计，专一性很高根据酶催化过程设计，专一性很高具有酶的底物性质，还有一个具有酶的底物性质，还有一个的反应基团在酶催化下的反应基团在酶催化下，与酶活性部位氨基酸侧链发生反应，不可逆地结合与酶活性部位氨基酸侧链发生反应，不可逆地结合Enzyme EngineeringEnzyme Engine
41、ering肽链有限水解修饰Peptide chain limit hydrolysis modification在肽链的在肽链的进行水解，使酶的空间结构发生精细改变，进行水解，使酶的空间结构发生精细改变，从而改变酶催化特性的修饰方法从而改变酶催化特性的修饰方法肽链是蛋白类酶的主链，是酶分子结构的基础肽链是蛋白类酶的主链，是酶分子结构的基础活性中心的肽段是酶催化作用必不可少的活性中心的肽段是酶催化作用必不可少的活性中心之外的肽段维持酶的空间构象活性中心之外的肽段维持酶的空间构象肽链被水解后可能出现的情况肽链被水解后可能出现的情况酶活性中心破坏，酶失去催化功能酶活性中心破坏，酶失去催化功能 探测酶
42、活性中心位置探测酶活性中心位置酶活性中心构象完整，酶活力保持不变或损失不多，但抗原性发酶活性中心构象完整，酶活力保持不变或损失不多，但抗原性发生变化生变化 提高酶的药用价值提高酶的药用价值活性中心形成，与底物结合能力提高并形成准确的催化部位活性中心形成，与底物结合能力提高并形成准确的催化部位 酶催化功能增强或酶活力提高酶催化功能增强或酶活力提高Enzyme EngineeringEnzyme Engineering肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰 酶切酶切/酶原激活法酶原激活法胃蛋白酶原（胃蛋白酶原（pepsinogen）的自激活）的自激活意义：保护作用，避免了过量的胃蛋白酶对胃壁
43、自身进行消化意义：保护作用，避免了过量的胃蛋白酶对胃壁自身进行消化Enzyme EngineeringEnzyme Engineering肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰 酶切酶切/酶原激活法酶原激活法胰蛋白酶原（胰蛋白酶原（trypsinogen）的水解激活）的水解激活 利用胰蛋白酶或肠激利用胰蛋白酶或肠激酶从酶从 trypsinogen 的的 N-端端切除一段六肽序列：切除一段六肽序列：N-Val(Asp)4LysEnzyme EngineeringEnzyme Engineering肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰 酶切酶切/酶原激活法酶原激活法胰凝乳蛋白酶原（胰
44、凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活）的激活Enzyme EngineeringEnzyme Engineering肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰 酶切酶切/酶原激活法酶原激活法Klenow 片段：基因工程的工具酶片段：基因工程的工具酶 E.coli DNA 聚合酶聚合酶 I 经经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的部分水解生成的 C-末端末端 605 个氨基酸残基片段。个氨基酸残基片段。保留了保留了 DNA 聚合酶聚合酶 I 的的 5 3 聚合酶和聚合酶和 3 5 外切酶活性，但缺少完整酶外切酶活性，但缺少完整酶的的 5 3 外切酶活
45、性。外切酶活性。Enzyme EngineeringEnzyme Engineering核苷酸链剪切修饰Nucleotide chain cleavage modification仅见于仅见于 R 酶的分子修饰，指在核苷酸酶的分子修饰，指在核苷酸链的限定位点进行剪切，使链的限定位点进行剪切，使 R 酶的结酶的结构发生改变，从而改变其催化特性的构发生改变，从而改变其催化特性的方法方法L-19 IVS 的形成的形成四膜虫（四膜虫（Tetrahymena）26S rRNA 前体自我剪接形成成熟的前体自我剪接形成成熟的 26S rRNA，同时生成同时生成414 nt 的线性间隔序列的线性间隔序列 LI
46、VS LIVS 经一系列剪接、环化、开环过经一系列剪接、环化、开环过程最终得到多功能程最终得到多功能 R 酶酶 L-19 IVS5 GA G 3 LIVS(414 nt)GA+(15 nt)(399 nt)G(395 nt)+(4 nt)L-19 IVS (395 nt)Enzyme EngineeringEnzyme Engineering氨基酸置换修饰Amino-acid substitute modification将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶催化特性的修饰方法变酶催化特性的修饰方法肽链上某个氨基酸的改变
47、会引起酶化学结构和空间构象的改变肽链上某个氨基酸的改变会引起酶化学结构和空间构象的改变氨基酸置换修饰的作用氨基酸置换修饰的作用提高酶的催化效率（例：酪氨酸提高酶的催化效率（例：酪氨酸-RNA 合成酶合成酶 Thr51 Pro51，对，对ATP 亲和力提高近亲和力提高近 100 倍，催化效率提高倍，催化效率提高 25 倍）倍）增强酶的稳定性（例：增强酶的稳定性（例：T4 溶菌酶溶菌酶 Ile3 Cys3，与，与 Cys97 形成二硫形成二硫键，热稳定性提高键，热稳定性提高）改变酶的专一性（例：农杆菌改变酶的专一性（例：农杆菌 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 Glu358 Ala358，失，失去水解活性，
48、却能催化糖苷合成去水解活性，却能催化糖苷合成）Enzyme EngineeringEnzyme Engineering氨基酸置换修饰置换修饰方法置换修饰方法 化学修饰化学修饰对某些侧链结构相近的氨基酸残基进行基团修饰，从而变成另对某些侧链结构相近的氨基酸残基进行基团修饰，从而变成另一种氨基酸残基一种氨基酸残基难度较大，很难精确操作难度较大，很难精确操作Enzyme EngineeringEnzyme Engineering氨基酸置换修饰置换修饰方法置换修饰方法 定点突变定点突变在在 DNA 序列中的某一特定位点上进行碱基的改变序列中的某一特定位点上进行碱基的改变蛋白质工程常用的技术手段蛋白质工
49、程常用的技术手段1983年，美国生物学家年，美国生物学家 Ulmer 首先提出了首先提出了“蛋白质工程蛋白质工程”的概念的概念蛋白质工程通过改造蛋白质相对应基因中的碱基排列次序，或设蛋白质工程通过改造蛋白质相对应基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到宿主细胞中，通过基因表达而获得计合成新的基因，将它克隆到宿主细胞中，通过基因表达而获得具有新特性的蛋白质的技术过程具有新特性的蛋白质的技术过程蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有诸蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有诸多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白质工程也被称为第二代多同基因工程技术相似的地方
50、，因此蛋白质工程也被称为第二代基因工程基因工程Enzyme EngineeringEnzyme Engineering找找出出欲欲置置换换的的氨氨基基酸酸位位置置mRNA核核苷苷酸酸序序列列酶酶蛋蛋白白氨氨基基酸酸序序列列突突变变基基因因核核苷苷酸酸序序列列氨基酸置换修饰定点突变主要步骤定点突变主要步骤1)新的分子结构设计新的分子结构设计根据已知蛋白酶的化学结构、空间结构及其特性，确定新蛋白质根据已知蛋白酶的化学结构、空间结构及其特性，确定新蛋白质或酶的氨基酸排列顺序，乃至欲置换的核苷酸及其位置或酶的氨基酸排列顺序，乃至欲置换的核苷酸及其位置2)突变基因的核苷酸序列确定突变基因的核苷酸序列确定
